CNBr活(huó)化(huà)的(dí)瓊(qióng)脂糖(táng)在(zài)製(zhì)備和使用(yòng)定(dìng)製親(qīn)和層析(xī)介質(zhì)方(fāng)麵具有良好(hǎo)的記(jì)錄。將生(shēng)物(wù)特異性(xìng)配體(tǐ)與CNBr活化的(dí)瓊脂糖(táng)偶聯(lián)是一(yī)項廣泛(fàn)使用(yòng)，成功(gōng)且(qiě)有(yǒu)據可(kě)查(chá)的技術(shù)。偶(ǒu)聯反應(yīng)是自(zì)發的，快(kuài)速(sù)的(dí)並且易於進(jìn)行。不(bù)需要(yào)有(yǒu)毒(dú)化學(xué)品或特(tè)殊製(zhì)備。

這種預活化的瓊脂糖基(jī)質可以(yǐ)很(hěn)容(róng)易(yì)地(dì)用於(yú)製(zhì)造各種(zhǒng)親和層(céng)析(xī)介(jiè)質，適(shì)用(yòng)於小規模(mó)和(hé)大(dà)規(guī)模純(chún)化(huà)應用(yòng)。應用領域包(bāo)括(kuò)蛋白(bái)質，多肽(tài)和核(hé)酸(suān)的固定(dìng)化。

1. 屬性(xìng)

由高度交聯的(dí)4%珠(zhū)狀瓊(qióng)脂糖製(zhì)成。它具(jù)有高機械剛度，可(kě)在(zài)降低背壓的(dí)情況下(xià)實(shí)現(xiàn)高流(liú)量(liáng)。

由於(yú)瓊脂糖(táng)具(jù)有出色的(dí)親水性(xìng)和(hé)低(dī)非特異性(xìng)結合特(tè)性，長期以(yǐ)來一(yī)直用於色譜(pǔ)分(fēn)離(lí)。這些顆粒(lì)具有開孔結(jié)構，對(duì)大蛋(dàn)白質分(fēn)子具(jù)有出色(sè)的傳質(zhì)性(xìng)能。

基(jī)礎(chǔ)基質(zhì)與溴化(huà)氫（CNBr）反應生成活(huó)性基團(tuán)，這(zhè)些活(huó)性基(jī)團(tuán)與待固(gù)定分子中(zhōng)的伯(bó)胺(àn)基團(tuán)反應。以(yǐ)添加添(tiān)加劑(jì)的凍(dòng)幹(gān)粉形(xíng)式提供。

表(biǎo)1  CNBr-activated SepFast 4HF的(dí)特(tè)性

2. 配(pèi)體(tǐ)固定化

以下(xià)是配體一(yī)般(bān)的(dí)偶聯流(liú)程(chéng)。

2.1    將目標配(pèi)體溶解(jiě)在(zài)含有0.5 M  NaCl的(dí)0.1 M  NaHCO3，pH  8.3的偶聯(lián)緩(huǎn)衝液(yè)中(zhōng)。對(duì)於(yú)蛋(dàn)白質配(pèi)體，凝(níng)膠濃度(dù)為5 - 20  mg/ml。對(duì)於小配(pèi)體(tǐ)，製作1 - 10µmol/ml凝膠。偶(ǒu)聯緩衝(chōng)液(yè)的體(tǐ)積應與(yǔ)固定凝(níng)膠(jiāo)的體積相同(tóng)。

2.2  稱取所(suǒ)需(xū)的(dí)粉(fěn)末（1 g幹粉提(tí)供約(yuē)9 ‑ 12 ml的沉(chén)降介(jiè)質(zhì)）並將其懸(xuán)浮(fú)在預(yù)冷(lěng)的 1 mM  HCl中（1 g 幹(gān)粉(fěn)使用(yòng)20  ml預冷的(dí)1 mM  HCl）。讓介質在低溫下(xià)膨(péng)脹(zhàng)2  -  3分(fēn)鐘(zhōng)。

2.3   快速去除(chú)過濾裝(zhuāng)置中的液體。

2.4  將洗(xǐ)淨吸(xī)幹的凝(níng)膠轉(zhuǎn)移到(dào)偶(ǒu)聯(lián)緩衝液(yè)中。

2.5  漿液(yè)在4℃下混合(hé)過夜或(huò)在(zài)室溫(wēn)下混合3-4小(xiǎo)時。

2.6 用至(zhì)少5 倍(bèi)凝膠體(tǐ)積的(dí)偶聯緩衝(chōng)液清洗凝膠(jiāo)。

2.7 將(jiāng)凝膠(jiāo)重新(xīn)懸浮到相同體(tǐ)積(jī)的(dí)封閉溶液(yè)中(zhōng)，0.1 M Tris/HCl，pH  8.0 或1  M  乙(yǐ)醇胺(àn) pH  8.0，持續2 - 3小時(shí)。

2.8 用5倍體積的(dí)0.1 M 0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0洗(xǐ)滌凝膠，然後用5倍(bèi)體積的(dí)0.1 M醋酸鹽緩(huǎn)衝液(yè) + 1 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠。

2.9 使用前(qián)用工(gōng)作/平衡緩(huǎn)衝液清洗凝膠。

3. 固定化(huà)效(xiào)率的一(yī)般(bān)考(kǎo)慮

3.1 pH

pH 8.3的緩衝液常用於蛋白(bái)質(zhì)固定。然(rán)而(ér)偶聯pH值(zhí)可在(zài)6-10之間(jiān)進(jìn)行優化(huà)以獲(huò)得(dé)最(zuì)佳結果（例如(rú)，高偶(ǒu)聯產率和高(gāo)配體活(huó)性(xìng)）。

注(zhù)意(yì)：配(pèi)體溶解(jiě)後(hòu)要調節偶聯pH值。

3.2 偶聯方案(àn)

應避免(miǎn)使用(yòng)含有氨基(jī)的溶液。

可以(yǐ)引入稀釋(shì)的某(mǒu)些有機溶劑(jì)以提高(gāo)配(pèi)體(tǐ)的(dí)溶(róng)解(jiě)度(dù)。應(yīng)事先(xiān)測試此類(lèi)溶劑的(dí)適用(yòng)性(xìng)。

3.3 鹽

偶聯緩衝(chōng)液中(zhōng)鹽(yán)的存(cún)在可以提(tí)高固定效率(shuài)。

3.4 基(jī)礎(chǔ)基(jī)質中的(dí)活(huó)化(huà)基(jī)團(tuán)

對(duì)於某(mǒu)些(xiē)配體(tǐ)或應用(yòng)，基(jī)礎(chǔ)基(jī)質中的(dí)活化水平可(kě)能過高(gāo)，偶(ǒu)聯配(pèi)體的活性可(kě)能會降(jiàng)低。

在降低的pH值(zhí)下(xià)偶聯可能會減少配(pèi)體分子的(dí)連(lián)接(jiē)點。它可(kě)以(yǐ)提(tí)高偶(ǒu)聯配體的活性(xìng)。活(huó)化基(jī)團的受控水解(jiě)，例(lì)如(rú)在添加配體前(qián)幾(jī)個小(xiǎo)時用偶(ǒu)聯緩衝液(yè)孵育凝(níng)膠，也可以減少過度偶聯問題。

3.5 屏蔽剩餘(yú)的活(huó)化配體(tǐ)

未(wèi)與(yǔ)配(pèi)體(tǐ)反(fǎn)應的活(huó)化基團(tuán)應通過添加(jiā)額外的含有(yǒu)pH 8 - 9伯(bó)胺的(dí)小(xiǎo)分(fēn)子(zǐ)（例(lì)如(rú)Tris或乙醇胺）來封(fēng)端。

3.6 最終(zhōng)介質(zhì)的洗(xǐ)滌(dí)

偶聯(lián)反(fǎn)應後需要將未(wèi)連(lián)接或弱(ruò)連接的配體(tǐ)完QUAN洗掉。采(cǎi)用高(gāo)pH值和低(dī)pH值交(jiāo)替(tì)的洗(xǐ)滌(dí)方(fāng)法可(kě)以確保有效(xiào)去除(chú)不需(xū)要的物(wù)質。

4. 固定(dìng)化親(qīn)和介(jiè)質的使用

配(pèi)體偶聯介質可用於(yú)使(shǐ)用(yòng)間(jiān)歇(xiē)攪拌罐模(mó)式或填充柱(zhù)模(mó)式的(dí)純化。處(chǔ)理這種材(cái)料遵(zūn)循(xún)與處理其(qí)他(tā)基於瓊(qióng)脂糖(táng)基質(zhì)相(xiāng)同的(dí)原則。

5. 儲存

凍(dòng)幹的應(yīng)在8℃下儲存。偶(ǒu)聯(lián)的濕介質應在(zài)防菌(jūn)劑（例(lì)如20%乙(yǐ)醇）存在的情況下於(yú)4-8℃儲(chǔ)存。切勿(wù)凍存(cún)耦(ǒu)合(hé)介(jiè)質。

6. 更(gēng)多(duō)信息(xī)

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