羧基活化的瓊脂糖(táng)可用(yòng)於固(gù)定含胺(àn)分(fēn)子。耦合化學是(shì)基於(yú)碳(tàn)二(èr)亞胺(àn)的
，是一項(xiàng)成(chéng)功(gōng)且有(yǒu)據可查的(dí)技術。

與(yǔ)含有(yǒu)伯胺基(jī)團(tuán)的配體(tǐ)形(xíng)成(chéng)化(huà)學穩(wěn)定的酰胺(àn)鍵
，它有(yǒu)一個長間隔區（9個(gè)原(yuán)子）。預(yù)活(huó)化的瓊脂糖基(jī)質(zhì)可以用(yòng)於製作各(gè)種定(dìng)製的親(qīn)和層析(xī)介(jiè)質
，適(shì)用於(yú)小(xiǎo)規模和(hé)大(dà)規(guī)模純化應用(yòng)。

1. 屬性

Carboxyl-activated SepFast 4 HF由(yóu)高度交(jiāo)聯(lián)的(dí)4%珠(zhū)狀(zhuàng)瓊脂(zhī)糖(táng)製(zhì)成(chéng)。它(tā)具(jù)有(yǒu)高機(jī)械剛度(dù)
，可(kě)在(zài)降(jiàng)低背壓的(dí)情況(kuàng)下(xià)實(shí)現高流量(liáng)。

由於瓊(qióng)脂(zhī)糖(táng)具(jù)有出(chū)色的親水性(xìng)和(hé)低非(fēi)特異(yì)性結合特性
，長期(qī)以來(lái)一直(zhí)用(yòng)於色(sè)譜分離。這些(xiē)顆粒(lì)具(jù)有開孔(kǒng)結構(gòu)
，對大蛋白質(zhì)分子具(jù)有出(chū)色的(dí)傳質性能。

通(tōng)過將(jiāng)長(cháng)的(dí)親(qīn)水(shuǐ)性(xìng)間隔(gé)臂(bì)連接到骨架(jià)上(shàng)來(lái)活化(huà)基(jī)礎基(jī)質。它直接(jiē)與分子中(zhōng)的伯(bó)胺(àn)基反應(yīng)
，在碳(tàn)二亞胺試劑(jì)存(cún)在(zài)下被固定。以20%乙(yǐ)醇(chún)中的水(shuǐ)懸浮液形式(shì)提(tí)供。

表1  Carboxyl-activated SepFast 4HF的特(tè)性

2. 配體(tǐ)固(gù)定(dìng)化

以(yǐ)下(xià)是(shì)配體一般(bān)的偶聯(lián)流(liú)程。

2.1  將(jiāng)目(mù)標(biāo)配(pèi)體溶解在(zài)偶聯(lián)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)中(zhōng)
，將(jiāng)pH值(zhí)調整為(wéi)4.5。偶聯緩(huǎn)衝(chōng)液的體(tǐ)積(jī)可(kě)以是固定凝膠體(tǐ)積(jī)的一半或相(xiāng)同。

2.2  在(zài)過濾(lǜ)裝置中(zhōng)用(yòng)至(zhì)少(shǎo)5 倍(bèi)體積的偶聯緩衝液清洗羧基(jī)活化凝膠(jiāo)。

2.3  將(jiāng)洗淨並吸(xī)幹的(dí)凝膠（來自(zì)步驟 2.2）轉移到(dào)步驟2.1 製備(bèi)的(dí)溶液(yè)中(zhōng)。

2.4  將(jiāng)碳二亞胺(àn)作為(wéi)幹(gān)粉或預先溶(róng)解(jiě)的溶(róng)液添(tiān)加(jiā)到(dào)漿液(yè)中
，最終濃(nóng)度(dù)為0.1 M。如(rú)果(guǒ)碳二亞(yà)胺預(yù)先溶解在水中(zhōng)
，則將pH值(zhí)調整(zhěng)為4.5。

2.5  在(zài)室溫或4-8℃下(xià)混(hùn)合漿料(liào)。

2.6   在(zài)第(dì)1個(gè)小(xiǎo)時內通(tōng)過添(tiān)加(jiā) 0.1  M NaOH調節反應(yīng)pH值(zhí)至4.5。

2.7 將偶聯反(fǎn)應放(fàng)置(zhì)2-24小(xiǎo)時(shí)。

2.8 用5倍體積的0.1 M 醋(cù)酸(suān)鹽(yán)緩(huǎn)衝液 + 0.5 M NaCl
，pH 4.0洗滌(dí)凝膠(jiāo)
，然後用(yòng)5倍(bèi)體積的(dí)0.1 M Tris/HCl + 0.5 M NaCl
，pH 8.0洗滌凝膠。重(zhòng)復上述洗滌2次(cì)以(yǐ)上。

2.9 使(shǐ)用前(qián)用工(gōng)作(zuò)/平衡(héng)緩(huǎn)衝(chōng)液清洗凝膠(jiāo)。

3. 固定(dìng)化(huà)效率的一(yī)般(bān)考慮(lǜ)

3.1 pH

偶聯反應在(zài)pH 4.5 - 7.5之間非(fēi)常(cháng)有效地進行。但(dàn)是可(kě)以優化偶聯pH以(yǐ)獲得最(zuì)佳(jiā)結果(guǒ)（例如(rú)
，高偶聯產(chǎn)率和高配體活(huó)性(xìng)）。

在(zài)偶(ǒu)聯反應的第1個小(xiǎo)時內
，pH值會降低(dī)。要記(jì)得通過(guò)添加(jiā)0.1 M NaOH來調(tiáo)節偶聯pH值(zhí)。之後pH值會(huì)趨於(yú)穩定。

3.2 偶(ǒu)聯方案

去(qù)離(lí)子水可直接用(yòng)作(zuò)偶聯(lián)溶液。應避免使(shǐ)用(yòng)含(hán)有(yǒu)氨(ān)基，巰基或(huò)羧(suō)基(jī)的緩衝(chōng)溶液
，因(yīn)為(wéi)它(tā)們會(huì)與配(pèi)體偶聯(lián)發生競(jìng)爭。

可以(yǐ)引入稀(xī)釋的某(mǒu)些(xiē)有機(jī)溶劑以提(tí)高(gāo)配體的溶解度。應事先測(cè)試此(cǐ)類溶劑(jì)的(dí)適(shì)用性。

3.3 碳二(èr)亞胺(àn)的(dí)選擇

應(yīng)使用(yòng)水(shuǐ)溶性碳二亞(yà)胺
，例(lì)如1‑乙基‑3‑(3‑二甲基(jī)氨(ān)基丙基(jī))碳(tàn)二亞(yà)胺  (EDC)  或1‑環己基‑3‑(2‑嗎啉代乙(yǐ)基) 碳二(èr)亞胺(àn)  (CMC)（通常(cháng)合成(chéng)為 metho‑p‑甲(jiǎ)苯磺酸鹽(yán)）。EDC是(shì)常用的(dí)碳(tàn)二(èr)亞(yà)胺(àn)試劑(jì)。

3.4 碳(tàn)二(èr)亞(yà)胺(àn)的濃度(dù)

添(tiān)加(jiā)的碳二(èr)亞胺的量應以(yǐ)化學計量(liáng)的(dí)方式超過(guò)活化的(dí)羧基。建(jiàn)議(yì)以(yǐ)最終反(fǎn)應(yīng)漿(jiāng)料中(zhōng)的(dí)0.1  M作為(wéi)起(qǐ)點。

3.5 反應(yīng)時(shí)間(jiān)和溫度

可以優化(huà)偶聯過(guò)程中配體和活化介(jiè)質之間的接觸時(shí)間以保持(chí)配體的生(shēng)物活性。

典(diǎn)型的反(fǎn)應時(shí)間(jiān)是(shì)在室(shì)溫(wēn)或冷藏(cáng)室中過夜(yè)。

3.6 屏蔽剩(shèng)餘(yú)的(dí)活化配(pèi)體

如(rú)果(guǒ)加(jiā)入過量的配體
，則可能不需要(yào)封(fēng)閉殘(cán)留的活(huó)化基(jī)團(tuán)。

未(wèi)與(yǔ)配(pèi)體(tǐ)反(fǎn)應的活化(huà)基(jī)團(tuán)應(yīng)在(zài)碳(tàn)二(èr)亞胺(àn)存(cún)在下(xià)通過(guò)添(tiān)加額(é)外的含有pH 8 - 9伯(bó)胺的(dí)小分子(zǐ)（例(lì)如1 M乙醇胺）來封(fēng)端。

3.7 最終介質(zhì)的(dí)洗(xǐ)滌

偶(ǒu)聯反(fǎn)應後需要將未連(lián)接(jiē)或弱連接(jiē)的(dí)配體WAN全洗(xǐ)掉。采(cǎi)用高pH值(zhí)和低pH值交(jiāo)替(tì)的洗滌方(fāng)法可(kě)以確保有(yǒu)效(xiào)去除(chú)不(bù)需要的物(wù)質。

4. 固定化(huà)親(qīn)和介質(zhì)的使用(yòng)

配體(tǐ)偶(ǒu)聯介質可用於使用間(jiān)歇攪拌罐模式(shì)或(huò)填充柱(zhù)模(mó)式的純化(huà)。處(chǔ)理這種(zhǒng)材(cái)料遵(zūn)循與(yǔ)處(chǔ)理其他基於(yú)瓊脂(zhī)糖(táng)基(jī)質相(xiāng)同的原則(zé)。

5. 儲(chǔ)存

應在8℃下(xià)儲存(cún)。偶聯的濕介(jiè)質(zhì)應在防(fáng)菌(jūn)劑（例(lì)如20%乙醇）存在的情況下於(yú)4-8℃儲存。切(qiē)勿(wù)凍存(cún)耦合(hé)介(jiè)質(zhì)。

6. 更(gēng)多(duō)信(xìn)息

了(liǎo)解(jiě)更多關(guān)於(yú)BioToolomics產(chǎn)品代理信息(xī)可聯(lián)係(xì)天津益元(yuán)利(lì)康的(dí)孫(sūn)經理(lǐ)。

7. 訂(dìng)購信息