隨著(zhuó)CAR-T治(zhì)療(liáo)的火熱
，細(xì)胞(bāo)和(hé)基(jī)因治(zhì)療也進(jìn)入(rù)了白(bái)re化的狀態
，細(xì)胞(bāo)培(péi)養(yǎng)就(jiù)稱為(wéi)通(tōng)向(xiàng)CAR-T治療的第一步(bù)。貼(tiē)壁細胞如何進行傳(chuán)代培養(yǎng)？讓(ràng)我們(mén)一(yī)起來看(kàn)看吧！

一(yī)，所需材(cái)料(liào)

 ★  裝有(yǒu)貼(tiē)壁細胞的培養(yǎng)容(róng)器

 ★  經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)處(chǔ)理的培(péi)養瓶，培養板或(huò)培(péi)養

 ★  wan全(quán)生(shēng)長培養基(jī)
，預(yù)熱(rè)至(zhì) 37℃

 ★  一(yī)次性無菌15ml試管

 ★  37 ℃培(péi)養(yǎng)箱(xiāng)
，充有二(èr)氧化碳(tàn)濃(nóng)度為 5%的(dí)濕化空氣

 ★  平(píng)衡(héng)鹽溶液
，例如(rú): 杜爾貝(bèi)科磷酸(suān)鹽緩衝液(yè) (DPBS)
，不(bù)含鈣，鎂(měi)和酚(fēn)紅消化酶
，例(lì)如
：胰蛋百(bǎi)酶
，不含(hán)酚紅

二(èr)，貼壁細胞(bāo)傳(chuán)代(dài)流(liú)程

細(xì)胞(bāo)培養(yǎng)一(yī)定(dìng)要保持工作區的(dí)無(wú)菌(jūn)清潔
，先用紫(zǐ)外(wài)燈(dēng)和(hé)臭(chòu)氧殺(shā)菌1h
，然後通風(fēng)30min
，操(cāo)作(zuò)前需要(yào)換(huàn)細胞間(jiān)專用拖(tuō)鞋(xié)
，雙(shuāng)手帶(dài)上一次性(xìng)橡膠手套(tào)並(bìng)用(yòng)75%乙醇(chún)消毒(dú)
，穿上(shàng)實(shí)驗(yàn)服(fú)
，戴(dài)上(shàng)一(yī)次性(xìng)口(kǒu)罩和帽子
，整個(gè)無菌操作都應該在酒精(jīng)燈(dēng)的周(zhōu)圍進(jìn)行。

1. 取對(duì)數生(shēng)長期的貼壁細胞
，棄(qì)掉舊培(péi)養(yǎng)基；

2. 用(yòng)磷酸鹽緩衝(chōng)液(yè) (PBS)衝洗細(xì)胞(bāo)1-2遍(biàn)。 (每10cm²培(péi)養表麵積需要2ml 溶液(yè))。從與貼(tiē)壁細(xì)胞(bāo)層相(xiāng)對(duì)的容器(qì)一側(cè)輕(qīng)輕加入(rù)衝洗液
，以避(bì)免攪(jiǎo)動細(xì)胞(bāo)層
，前後(hòu)搖(yáo)晃(huǎng)容器數(shù)次；注(zhù):衝(chōng)洗步驟(zhòu)可去(qù)除可能(néng)抑(yì)製消化酶(méi)作用(yòng)的少(shǎo)量(liáng)血(xiě)清(qīng)鈣和鎂。

3. 從(cóng)培養容(róng)器中吸(xī)出衝洗液並丟棄(qì)；

4. 向(xiàng)培養瓶(píng)中(zhōng)加(jiā)入(rù)預熱的消化酶(例如:胰蛋(dàn)白酶);試劑量應足以覆蓋(gài)細胞層(每(měi)10cm²大約(yuē)0.5ml)。輕輕(qīng)搖晃(huǎng)容器(qì)
，使(shǐ)試劑wan全(quán)覆蓋細(xì)胞層；

5. 將培養容器在室(shì)溫下孵育約2分鐘(zhōng)；

請(qǐng)注意(yì)
，實際(jì)孵育(yù)時(shí)間(jiān)根(gēn)據(jù)所用(yòng)細胞係(xì)不同(tóng)可(kě)能(néng)有所差異(yì)。

6. 在(zài)顯微鏡下觀察細胞解離情(qíng)況(kuàng)。如(rú)果(guǒ)解離程度未(wèi)達(dá)90%
，可將孵(fū)育時間延(yán)長(cháng)幾分鐘(zhōng)
，每30秒鐘(zhōng)檢查一次解(jiě)離(lí)情況。也可輕(qīng)輕拍(pāi)打(dǎ)培(péi)養(yǎng)容(róng)器以加快細(xì)胞解(jiě)離(lí)。

7. 細胞解(jiě)離程度(dù)大於等(děng)於90%時(shí)
，傾(qīng)斜(xié)培(péi)養(yǎng)容(róng)器
，使細胞(bāo)上液體(tǐ)盡(jìn)快流盡。加入(rù)所用(yòng)消(xiāo)化酶兩(liǎng)倍體(tǐ)積的(dí)預熱(rè)wan全生(shēng)長培養(yǎng)基(jī)。輕(qīng)柔(róu)吹打細(xì)胞層表麵數次(cì)
，使(shǐ)細胞(bāo)分散(sàn)成(chéng)為(wéi)單(dān)細(xì)胞懸液。

8. 將(jiāng)細(xì)胞(bāo)轉(zhuǎn)移(yí)到15ml離心管中
，200g 離心(xīn)5至10分鐘(zhōng)。

請注意(yì)
：離(lí)心速(sù)度(dù)和時間(jiān)依細胞(bāo)種(zhǒng)類不(bù)同(tóng)而(ér)有所差異。

9. 用最(zuì)少體積的預熱wan全生(shēng)長培(péi)養基(jī)重新懸浮細(xì)胞沉澱。

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