熒光標記(jì)在生(shēng)物(wù)學(xué)眾(zhòng)多(duō)的研究(jiū)領域中有著(zhuó)十分廣泛(fàn)的應用(yòng)
，已(yǐ)經成(chéng)為研究體內或細胞成像及(jí)生物細胞功(gōng)能(néng)的重要工(gōng)具
。熒光(guāng)標記方(fāng)式(shì)一(yī)般有(yǒu)兩種(zhǒng)
，一種是細(xì)胞(bāo)表達的(dí)熒光蛋(dàn)白
，另外(wài)一(yī)種是化學合成(chéng)的熒光分(fēn)子
，此(cǐ)外
，螢光素(sù)酶(méi)也是細胞標記的常用方法(fǎ)
。每一種(zhǒng)熒光(guāng)分(fēn)子都有其(qí)獨te的(dí)激發(fā)波長和發射(shè)波長(cháng)
。螢光(guāng)素(sù)酶不同於熒(yíng)光分(fēn)子
，其(qí)發(fā)光(guāng)機製是(shì)利用(yòng)酶與底物的(dí)反應
，催化(huà)發出的(dí)化(huà)學發光
，其(qí)發光(guāng)並不(bù)需要激發光的參與
，常(cháng)用於(yú)體(tǐ)內成(chéng)像及(jí)螢光素酶(méi)報(bào)告基(jī)因的(dí)定量實(shí)驗
。熒(yíng)光蛋(dàn)白如(rú)何選(xuǎn)擇呢(ní)
？讓我們一(yī)起來(lái)看看吧！

一(yī)，激(jī)發(fā)波(bō)長/發(fā)射(shè)波長

每一種(zhǒng)熒(yíng)光(guāng)蛋白都(dū)有其獨(dú)te的激發(fā)波長(cháng)和發(fā)射波長
，因此
，選擇(zé)的(dí)熒(yíng)光(guāng)蛋(dàn)白(bái)必須(xū)是(shì)手上係統能(néng)夠激(jī)發和檢測(cè)得到的
。舉(jǔ)例
，如果(guǒ)你的(dí)顯微(wēi)鏡隻有488nm和561nm兩(liǎng)個(gè)激發器
，那(nà)你就不(bù)能夠選(xuǎn)擇遠紅外(wài)熒(yíng)光蛋白
。又比如當使(shǐ)用不(bù)止一(yī)個熒光蛋白時(shí)
，確保(bǎo)他們(mén)的發(fā)射波(bō)長沒(méi)有(yǒu)重疊(dié)
，建議熒光(guāng)使(shǐ)用(yòng)先後(hòu)順序(xù)
，GFP/RFP/BFP/YFP/CFP
。

二，寡聚(jù)反應(yīng)

第(dì)一(yī)代(dài)熒光蛋白易於寡(guǎ)聚化
，當和目(mù)的(dí)基(jī)因融(róng)合表達(dá)時(shí)
，可能會(huì)影響(xiǎng)目(mù)的(dí)基因蛋白(bái)的生物學功(gōng)能
。因(yīn)此(cǐ)做融(róng)合表(biǎo)達(dá)時建議(yì)使用單(dān)體(tǐ)的熒(yíng)光(guāng)蛋白
，比如(rú)mCherry/EGFP
。

三，氧氣(qì)

許多(duō)熒(yíng)光蛋(dàn)白的(dí)成熟(shú)需要氧(yǎng)氣(qì)
，特別(bié)是(shì)衍(yǎn)生自(zì)GFP的那些(xiē)熒光(guāng)蛋白(bái)
，如EGFP/ECFP/EYFP
。如果這(zhè)些熒光蛋(dàn)白(bái)處於(yú)缺氧(yǎng)環境
，那(nà)可(kě)能就(jiù)觀察不(bù)到熒(yíng)光
。

四，成(chéng)熟(shú)時間(jiān)

成熟時間是(shì)熒光蛋白正確(què)折疊和產(chǎn)生發色團所需的(dí)時間
，時間(jiān)可(kě)能(néng)是幾分(fēn)鐘(zhōng)到幾小(xiǎo)時
。舉例：superfolder GFP (sfGFP) 和mNeonGFP在37°C所需時間小於(yú)10min；mCherry 需要大概(gài)15min；TagRFP 需(xū)要大概100min；DsRed 大概需要10hours
。

五(wǔ)，溫度(dù)

溫度會影響熒光蛋(dàn)白(bái)的成熟(shú)時間和熒(yíng)光強(qiáng)度
，比如EGFP適合37°C
，所(suǒ)以(yǐ)EGFP最shi合哺乳動物(wù)或者細(xì)菌的研究
，而(ér)GFPS65T相對適(shì)合酵母的研(yán)究(jiū)
。

六(liù)，亮(liàng)度

熒(yíng)光(guāng)蛋白(bái)的(dí)亮(liàng)度(dù)值由(yóu)消(xiāo)光(guāng)係(xì)數與量子(zǐ)產率(shuài)的乘積計(jì)算(suàn)得出
。在許(xǔ)多情(qíng)況下(xià)
，將熒光蛋白(bái)的亮度與(yǔ)EGFP(設(shè)定為1)進(jìn)行比較(jiào)
，有(yǒu)一(yī)些熒(yíng)光(guāng)蛋(dàn)白(bái)非(fēi)常暗(àn)淡(dàn)（例如(rú)TagRFP657
，其(qí)具有亮(liàng)度隻(zhī)有0.1）
，因(yīn)此亮度也需要(yào)考慮(lǜ)
。

七(qī)，耐光(guāng)性(xìng)

長(cháng)時間暴(bào)露(lòu)在(zài)激發光(guāng)下(xià)
，熒(yíng)光分(fēn)子被漂白（即(jí)失(shī)去發光(guāng)的(dí)能力(lì)）
。光穩定性可短至100毫秒(miǎo)（如EBFP）或長達(dá)1小(xiǎo)時(shí)（如(rú)mAmetrine1.2）
。但是(shì)
，對(duì)於大多(duō)數熒(yíng)光(guāng)蛋白來(lái)說
，它(tā)隻需幾秒鐘到(dào)幾分鐘
。另(lìng)外(wài)
，光(guāng)穩定(dìng)性可能(néng)也(yě)會(huì)受實驗(yàn)參數(shù)影響
，例(lì)如激(jī)發(fā)光強度
，pH或溫度等(děng)
。

八(bā)，pH穩(wěn)定性

如果計劃(huá)在酸性環境中表達(dá)熒光蛋白
，則(zé)此(cǐ)參數非常重(zhòng)要(yào)
，一些(xiē)熒(yíng)光蛋白(bái)具(jù)有(yǒu)不(bù)同(tóng)的ex/em光(guāng)譜（例(lì)如mKeima）或在pH變化(huà)時熒光強度會發(fā)生改(gǎi)變（例(lì)如(rú)pHluorin
，pHTomato）
，sensGFP在酸性環境會淬滅
，如(rú)StubRFP-SensGFP-LC3B自(zì)噬(shì)探針
。

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