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一(yī)，樣品(pǐn)製備(bèi)

1. 組(zǔ)織(zhī)固(gù)定：根據要求(qiú)收(shōu)集人(rén)或動物的(dí)組織(zhī)用於IHC分析，衝洗(xǐ)並(bìng)用(yòng)固定(dìng)劑(jì)（一般(bān)用(yòng)甲(jiǎ)醛）進行(háng)固定

2. 組(zǔ)織(zhī)包埋：將經甲醛固(gù)定(dìng)的組(zǔ)織嵌入石(shí)蠟(là)，以長期保(bǎo)持(chí)其天(tiān)然(rán)形(xíng)狀和(hé)組(zǔ)織結(jié)構

3. 切片安(ān)裝：將(jiāng)組織樣品(pǐn)在(zài)切片(piàn)機(jī)上切片，並(bìng)轉移(yí)至(zhì)載(zǎi)玻(bō)片(piàn)上幹燥保(bǎo)持(chí)其形(xíng)態

4. 脫蠟(là)水化：因切片(piàn)上的石(shí)蠟會(huì)妨(fáng)礙染色(sè)，所(suǒ)以(yǐ)需(xū)將切片(piàn)上(shàng)的石(shí)蠟溶(róng)出(chū)，並水(shuǐ)化。脫蠟(là)或水化(huà)不(bù)全容易造成非(fēi)特異性背景著色（一般的(dí)脫蠟(là)水化(huà)步驟是：將切(qiē)片依(yī)次浸(jìn)入(rù)二(èr)甲(jiǎ)苯Ⅰ10min-二(èr)甲苯(běn)Ⅱ10min-無水乙醇5min-95%無(wú)水乙(yǐ)醇5min-90%無(wú)水乙(yǐ)醇5min-80%無(wú)水(shuǐ)乙(yǐ)醇5min-70%無水乙醇(chún)5min-50%無(wú)水乙醇5min-蒸(zhēng)餾(liù)水5min×3，進行脫蠟(là)水(shuǐ)化(huà)）。

5. 抗原修復：由(yóu)於組織在甲(jiǎ)醛固(gù)定(dìng)過(guò)程中，蛋白之間發生了交聯及醛基(jī)的(dí)封閉(bì)從而(ér)掩蓋抗原決定簇。可(kě)以(yǐ)通過(guò)高壓加(jiā)熱修復抗(kàng)原(yuán)，使細(xì)胞(bāo)內抗原決(jué)定族暴(bào)露，從而提高抗(kàng)原檢(jiǎn)測(cè)率。

6. 非特定位點封閉：為了(liǎo)防(fáng)止一(yī)抗的(dí)非特(tè)異(yì)性結(jié)合(hé)造(zào)成假(jiǎ)陽(yáng)性，可(kě)以選(xuǎn)用BSA，羊血(xiě)清等封閉(bì)非(fēi)特異(yì)性(xìng)結(jié)合(hé)位(wèi)點(diǎn)。封(fēng)閉(bì)血清來源一般(bān)與二抗保持一(yī)致，室溫封閉10-30min。

二，樣品(pǐn)染色

1. 一(yī)抗，二(èr)抗孵育(yù)：抗體孵育(yù)時間(jiān)，溫度(dù)及(jí)濃(nóng)度(dù)等(děng)因素對染色(sè)結果都存在很大影響。在4℃下反應(yīng)緩慢，背景(jǐng)較淺(qiǎn)；37℃反應(yīng)較快(kuài)時間(jiān)較短；而室溫介於兩者(zhě)之(zhī)間，選擇室溫(wēn)有(yǒu)利(lì)於實驗(yàn)的進行。二抗一(yī)般室溫孵育30min。

2. 底(dǐ)物顯色：基於(yú)與酶(méi)綴合的(dí)二(èr)抗(kàng)，抗(kàng)原通過生色或(huò)熒(yíng)光方式直接(jiē)檢(jiǎn)測(cè)。

3. 復染(rǎn)封片(piàn)：組(zǔ)化染(rǎn)色後進行(háng)復(fù)染(rǎn)可以(yǐ)襯(chèn)托(tuō)出組(zǔ)織形(xíng)態結(jié)構(gòu)，常(cháng)用的(dí)復染劑有(yǒu)蘇木(mù)精，曙紅，甲基(jī)綠，DAPI和Hoechst熒光染(rǎn)色。觀(guān)察結束(shù)後(hòu)使(shǐ)用(yòng)中性樹膠(jiāo)進行(háng)封片，可以長(cháng)久保存(cún)。

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