你知道(dào)什麼(mó)是(shì)Sanger雙(shuāng)脫氧鏈(liàn)終(zhōng)止法嗎？讓(ràng)我們一(yī)起來看(kàn)看(kàn)吧(bā)！

一，原(yuán)理(lǐ)

Sanger雙脫氧(yǎng)鏈終止法(fǎ)是(shì)第(dì)一(yī)代(dài)測序(xù)技術中最(zuì)為(wéi)經典(diǎn)的一種(zhǒng)
。其巧妙(miào)的利(lì)用(yòng)DNA復(fù)製(zhì)原理,利用(yòng)ddNTP來部分代(dài)替常(cháng)規的dNTP作(zuò)為(wéi)底物進(jìn)行DNA合(hé)成反應
。在(zài)DNA合成(chéng)時(shí),一(yī)旦(dàn)ddNTP參(cān)入到合成DNA鏈(liàn)中,由於ddNTP脫氧核(hé)糖(táng)的(dí)3’-位碳(tàn)原子上缺(quē)少(shǎo)羥基，而(ér)不能與下(xià)一(yī)位(wèi)核苷(gān)酸(suān)的5’-位(wèi)磷(lín)酸(suān)基之(zhī)間形成3’,5’-磷(lín)酸二(èr)酯鍵，從(cóng)而使得正在(zài)延伸的(dí)DNA鏈在此(cǐ)ddNTP處(chǔ)終(zhōng)止(zhǐ)
。

二，實(shí)驗步(bù)驟

1. 將待測序測(cè)序的DNA片(piàn)段進行PCR擴增(zēng)，得(dé)到(dào)充足(zú)的DNA模(mó)版(bǎn)用於進(jìn)行(háng)測(cè)序
。

得(dé)到的(dí)DNA模板需要進(jìn)行純化，需要確(què)保去除(chú)所有(yǒu)雜質(zhì)，包括(kuò)DNA片段(duàn)，蛋(dàn)白質(zhì)，RNA等
。

2. 根據待測(cè)序列的特點(diǎn)與實驗(yàn)要(yào)求，設(shè)計一些特定(dìng)的引物
。

一般來(lái)說，通用(yòng)引(yǐn)物的長(cháng)度以(yǐ)15～30bp為(wéi)宜(yí)
。

3. 合成標記物(wù)
。標(biāo)記物是指(zhǐ)示(shì)測序反應(yīng)是(shì)否(fǒu)成(chéng)功的(dí)物(wù)質，通常(cháng)是一(yī)種熒(yíng)光染料或(huò)放射性同位(wèi)素(sù)
。

4. 將DNA模(mó)板，引物，DNA聚合酶和標(biāo)記(jì)物(wù)等(děng)物質混(hùn)合在一(yī)起(qǐ)，進行(háng)測(cè)序反(fǎn)應(yīng)
。

在反應(yīng)過程(chéng)中，DNA聚(jù)合酶將(jiāng)根據(jù)DNA模(mó)板(bǎn)中的(dí)鹼(jiǎn)基(jī)序列合成(chéng)新的DNA鏈，同時(shí)將(jiāng)標記物結(jié)合到(dào)新(xīn)合成(chéng)的DNA鏈中
。

5. 將(jiāng)反應產物進(jìn)行電泳分離，根(gēn)據(jù)標記物(wù)的不(bù)同熒(yíng)光信號或放(fàng)射(shè)性(xìng)同(tóng)位(wèi)素的存(cún)在(zài)，確定(dìng)DNA序(xù)列(liè)中的鹼基排列(liè)順序(xù)
。

在(zài)Sanger測(cè)序(xù)法的基礎上(shàng)，將熒(yíng)光(guāng)信(xìn)號接收器和計(jì)算(suàn)機信號分(fēn)析(xī)係統替(tì)代(dài)放(fàng)射自(zì)顯影技(jì)術(shù)，使用(yòng)熒光(guāng)素(sù)標記替(tì)代(dài)32P或(huò)35S單一放(fàng)射(shè)性(xìng)核素(sù)標(biāo)記(jì)，打開了DNA測序技術自動(dòng)化(huà)的(dí)大(dà)門(mén)
。

三，Sanger測(cè)序法(fǎ)的優缺點(diǎn)

優點：

1. Sanger是直(zhí)接(jiē)對DNA分子進(jìn)行測序(xù)，適用於已(yǐ)知(zhī)序(xù)列的(dí)驗證測序(xù)，文(wén)庫(kù)篩選(xuǎn)，克隆(lóng)鑒定，pcr重測(cè)序(xù)等(děng)
。

2. 其(qí)zui大優點在於讀取速度很(hěn)高，高精(jīng)確度，而且(qiě)成本(běn)相對(duì)很低(dī)
。相較於(yú)化學降解測序法(fǎ)，對(duì)於富(fù)含G-C的區域(yù)也(yě)不會(huì)影響測序效果
。

缺點：

1. 必須(xū)有(yǒu)已(yǐ)經序(xù)列設(shè)計(jì)測(cè)序引物，對(duì)於(yú)未知序列(liè)必須構建(jiàn)克(kè)隆後才能測(cè)序，難以(yǐ)實現基(jī)因組(zǔ)水(shuǐ)平的大(dà)規模測序(xù)
。

2. 測(cè)定鹼基序(xù)列需(xū)要(yào)大量wan全(quán)相同的(dí)DNA拷(kǎo)貝
。

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