Trizol是(shì)一種(zhǒng)酸性試(shì)劑，能(néng)從細(xì)胞(bāo)和(hé)組織中(zhōng)快速分(fēn)離(lí)RNA，其(qí)主要(yào)成分為異(yì)硫(liú)氰(qíng)酸胍(GITC)和(hé)苯酚。裂解細(xì)胞後(hòu)，GITC能(néng)使(shǐ)蛋(dàn)白質(zhì)和(hé)RNase變性，有利(lì)於保護(hù)RNA的完(wán)整性；加(jiā)入(rù)氯仿(fǎng)離(lí)心後，樣(yàng)品分為(wéi)水相(xiāng)和有機相，RNA存在於(yú)上層水(shuǐ)相中(zhōng)，而(ér)DNA和(hé)蛋白質則存(cún)在於中(zhōng)間層(céng)及(jí)下層有(yǒu)機相(xiāng)中，從而達(dá)到分離的(dí)目的。簡單(dān)來講(jiǎng)就(jiù)是裂(liè)解細(xì)胞使RNA得以釋放(fàng)，加之有機(jī)溶劑使RNA與DNA，蛋白(bái)質分離(lí)，並進一步(bù)純(chún)化(huà)得到RNA的過(guò)程(chéng)。那麼你知(zhī)道Trizol法(fǎ)RNA提(tí)取的實驗流程和(hé)注(zhù)意事項是(shì)什麼嗎？讓(ràng)我們一(yī)起來看(kàn)看吧(bā)！
 

　　1.樣品的製備(bèi)
 

　　1)細胞：按1ml Trizol試劑/5-10×10^6細(xì)胞(bāo)的比(bǐ)例加入(rù)Trizol試(shì)劑(注(zhù)：一(yī)般(bān)來講待細(xì)胞(bāo)在六(liù)孔(kǒng)板上(shàng)生(shēng)長至80%左右時，每孔(kǒng)收集的(dí)細(xì)胞(bāo)加1ml Trizol即(jí)可(kě))；
 

　　2)組織：按(àn)1ml Trizol試劑/50-100mg組織的比(bǐ)例(lì)加(jiā)入Trizol試(shì)劑(jì)並在(zài)冰上(shàng)匀漿(jiāng)處理(lǐ)，以利於(yú)RNA的釋(shì)放(fàng)(注：組織可以(yǐ)先用液(yè)氮(dàn)急凍(dòng)後研磨(mó)處理，也(yě)可用匀漿器或者(zhě)組(zǔ)織研(yán)磨器進行處理，但要注意(yì)保(bǎo)持低溫，以防RNA降(jiàng)解(jiě))；
 

　　室溫裂解5-10min。
 

　　2.氯(lǜ)仿抽提
 

　　每(měi)1ml Trizol中(zhōng)加入(rù)200ul的(dí)氯仿(fǎng)，蓋(gài)好(hǎo)EP管(guǎn)蓋後(hòu)用(yòng)手(shǒu)劇烈顛倒混(hùn)匀15s左(zuǒ)右(yòu)，室溫(wēn)孵(fū)育2-3min。2-8℃，12000g離(lí)心15min後溶(róng)液(yè)分為三(sān)層，從上到下依次為(wéi)水相(xiāng)(RNA)，中間層及(jí)有(yǒu)機(jī)相(xiāng)(DNA，蛋(dàn)白(bái)質等)，轉移水(shuǐ)相至新的(dí)EP管中(注：此(cǐ)步一定要小心(xīn)謹慎，慢慢吸取，不(bù)可(kě)觸(chù)及中間(jiān)層，以(yǐ)免RNA被汙染)。
 

　　3.異丙醇沉(chén)澱(diàn)
 

　　每(měi)1ml Trizol中(zhōng)加入(rù)500ul異(yì)丙(bǐng)醇，上(shàng)下顛倒混匀(yún)後，室溫孵(fū)育(yù)10min，2-8℃，12000g離心10min，得(dé)到(dào)的白色(sè)沉澱(diàn)即為RNA沉澱(注：異丙醇最(zuì)好(hǎo)提(tí)前(qián)預(yù)冷，維(wéi)持(chí)低溫環境，以防RNA被降(jiàng)解(jiě))。
 

　　4.乙醇洗滌
 

　　棄去(qù)上清(qīng)，加(jiā)入1ml 75%乙(yǐ)醇(每(měi)1ml Trizol)洗(xǐ)滌(dí)RNA沉澱(diàn)，2-8℃，7500g離心5min(注(zhù)：75%乙醇(chún)可以用無(wú)水(shuǐ)乙醇(chún)及(jí)無酶(méi)水來(lái)配(pèi)製，同(tóng)樣最(zuì)好預冷處(chǔ)理(lǐ)；清(qīng)洗(xǐ)時動作要輕柔(róu)，過(guò)於劇(jù)烈會導致RNA沉澱散開(kāi)，再次離心未(wèi)免會重聚，從(cóng)而造成(chéng)RNA的損失)。
 

　　5.溶(róng)解
 

　　棄去(qù)上(shàng)清，於通(tōng)風櫥(chú)內(nèi)幹燥(zào)RNA沉澱5-10min，用50ul左(zuǒ)右的無酶(méi)水重懸(xuán)沉澱(diàn)，即可得到(dào)RNA溶(róng)液(注：幹(gān)燥時間(jiān)不(bù)可(kě)過長(cháng)，太過(guò)幹(gān)燥會(huì)導(dǎo)致沉(chén)澱(diàn)很難(nán)溶解，部分(fēn)溶解的(dí)RNA的260/280的(dí)比值(zhí)會(huì)大大(dà)降低(dī)，甚至低(dī)於(yú)1.6；亦可(kě)采(cǎi)用金(jīn)屬(shǔ)浴(yù)60℃，5min以(yǐ)助溶)。
 

　　6.RNA質量(liáng)的檢(jiǎn)測
 

　　1)微量分光(guāng)光度計
 

　　純(chún)RNA的260/280比值(zhí)在(zài)2.0左(zuǒ)右(yòu)，若比值偏(piān)小，則代表(biǎo)可能(néng)有(yǒu)蛋白或有機(jī)溶劑的汙染，比值偏大則代(dài)表RNA可能發(fā)生降解。
 

　　2)瓊(qióng)脂糖(táng)凝(níng)膠電泳
 

　　可(kě)見三條帶(dài)，從上往(wǎng)下(xià)一般為28s RNA，18s RNA及5s RNA，一(yī)般情況(kuàng)下5s的帶非常(cháng)淡，甚至(zhì)看不(bù)清，28s帶(dài)的亮度應(yīng)為(wéi)18s帶(dài)亮度的(dí)2倍，且(qiě)不存在拖尾，即(jí)可(kě)證(zhèng)明(míng)RNA純(chún)度可(kě)以，如(rú)若5s很明(míng)顯，而(ér)28s 與(yǔ)18s帶(dài)的亮度並(bìng)無(wú)太大(dà)差別，甚至出現塗抹(mǒ)狀的條帶則(zé)高度提示RNA降解。
 

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