原代細(xì)胞(bāo)分(fēn)離(lí)培(péi)養是一(yī)項(xiàng)實驗技術，它(tā)涉及從生物體中(zhōng)提取組(zǔ)織或細(xì)胞，並將(jiāng)它們轉移到(dào)體(tǐ)外(wài)環境(jìng)中進行培養(yǎng)
。這(zhè)些來源包(bāo)括各種(zhǒng)組織(zhī)器官(guān)，外周血和胚胎等(děng)
。在培養過(guò)程中，原代(dài)細胞(bāo)的生長速(sù)度相(xiāng)對較慢，通常在培(péi)養的(dí)前10代(dài)內停止(zhǐ)生(shēng)長
。因(yīn)此，通常(cháng)將(jiāng)培(péi)養的(dí)細(xì)胞(bāo)歸類(lèi)為原代細胞(bāo)培養(yǎng)，這些(xiē)細胞包(bāo)括第(dì)1到(dào)第10代的細胞
。下(xià)麵讓我(wǒ)們一(yī)起來看看(kàn)原(yuán)代(dài)細(xì)胞分(fēn)離(lí)的(dí)注意事項(xiàng)與常見問(wèn)題(tí)吧
！
 

　　一，常見(jiàn)問(wèn)題(tí)
：
 

　　1. 保存血清(qīng)好的方法是(shì)什麼？
 

　　建(jiàn)議將血清(qīng)存(cún)放在 -5℃ 至 -20℃的溫度(dù)範圍(wéi)內(nèi)
。如果(guǒ)存(cún)放在(zài)4℃，請不要超過(guò)一(yī)個(gè)月(yuè)
。如果無(wú)法一次(cì)使(shǐ)用完整瓶血(xiě)清，建(jiàn)議將血(xiě)清(qīng)經過無(wú)菌分裝(zhuāng)後(hòu)存放在適(shì)當的(dí)滅菌(jūn)容器(qì)中，然(rán)後(hòu)再放回冷凍
。
 

　　2. 如(rú)何解凍血清以保持其(qí)最佳培養狀態？
 

　　建(jiàn)議(yì)將血(xiě)清從冷凍(dòng)箱(xiāng)中(zhōng)取(qǔ)出後(hòu)，首先(xiān)放(fàng)置(zhì)在2～8℃的(dí)冰箱中(zhōng)使(shǐ)其融化(huà)，然(rán)後在室溫下使其(qí)融(róng)化(huà)
。但務必要注意，在融(róng)解過(guò)程(chéng)中必須(xū)規律(lǜ)地(dì)搖晃(huǎng)以(yǐ)確保(bǎo)均(jūn)匀
。
 

　　3. 血(xiě)清解(jiě)凍後(hòu)發現(xiàn)有絮狀沉澱(diàn)物(wù)出現(xiàn)，應(yīng)該如何(hé)處(chǔ)理？
 

　　血(xiě)清中出現(xiàn)沉(chén)澱物有很(hěn)多原因，但最常見的(dí)是由(yóu)於(yú)血清(qīng)中脂(zhī)蛋(dàn)白的變(biàn)性(xìng)所致
。此(cǐ)外，血清解(jiě)凍後血(xiě)纖維(wéi)蛋(dàn)白的存(cún)在也(yě)可能(néng)導(dǎo)致沉(chén)澱物的(dí)生成(chéng)
。
 

　　1. 通(tōng)過使(shǐ)C57BL/6小鼠頸椎(zhuī)脫臼死(sǐ)亡(wáng)，然(rán)後用適(shì)量(liáng)的(dí)酒精(jīng)噴灑和(hé)Buffer滴(dī)加(jiā)的(dí)方式(shì)，快速(sù)分離結(jié)腸(cháng)
。
 

　　2. 沿(yán)著腸係膜進(jìn)行剪開(kāi)，利用DMEM培(péi)養基清(qīng)洗結(jié)腸(cháng)，以去除其中(zhōng)的(dí)腸腔內容物(wù)
。
 

　　3. 使(shǐ)用無菌(jūn)剪(jiǎn)刀(dāo)將(jiāng)結腸組織(zhī)剪成(chéng)約(yuē)1mm³大小的碎片
。
 

　　4. 使(shǐ)用(yòng)10 mL 0.1%膠原(yuán)酶(méi)I和(hé)3%分(fēn)散酶(méi)II對(duì)組織(zhī)進(jìn)行消(xiāo)化(huà)，在(zài)37℃的(dí)搖床(chuáng)上(shàng)消(xiāo)化25分鐘(zhōng)
。
 

　　5. 進行吹(chuī)打混匀，並(bìng)通(tōng)過(guò)100μm細(xì)胞過濾器(qì)過濾，以收集(jí)上(shàng)清液
。
 

　　6. 采用(yòng)相差(chà)消化(huà)法(fǎ)和差(chà)速貼壁(bì)法去除成(chéng)纖維(wéi)細胞
。
 

　　7. 加入1 mL培(péi)養(yǎng)基，將細胞(bāo)懸浮(fú)後接(jiē)種於含有培養(yǎng)基的(dí)培(péi)養(yǎng)瓶中(zhōng)，在37℃，5% CO2的細胞(bāo)培養箱中(zhōng)培(péi)養
。
 

　　8. 當細胞(bāo)生長(cháng)至培養瓶的(dí)80-90%時，使(shǐ)用(yòng)5 g/L胰(yí)酶(méi)消化液進行(háng)消化，然(rán)後(hòu)將其接(jiē)種於細(xì)胞培養板(bǎn)中(zhōng)
。
 

　　二(èr)，注(zhù)意(yì)事(shì)項
：
 

　　原代(dài)細(xì)胞培養具有(yǒu)較高的成本，並(bìng)對培(péi)養(yǎng)條件(jiàn)有嚴(yán)格要(yào)求
。因此(cǐ)，在(zài)培養過(guò)程中(zhōng)需(xū)要(yào)特(tè)別注(zhù)意保(bǎo)持(chí)無菌環境(jìng)，並盡可能去除目標細胞(bāo)以(yǐ)外的其他細(xì)胞
。
 

　　1. 在實驗開(kāi)始前，必須(xū)對(duì)所(suǒ)有器械進(jìn)行(háng)消毒(dú)處理，並進行(háng)高(gāo)壓(yā)滅菌(jūn)，液體(tǐ)則需要(yào)進(jìn)行無菌過(guò)濾處理(lǐ)
。
 

　　2. 酶(méi)消(xiāo)化(huà)液必須(xū)立即現用(yòng)現配(pèi)，以確保其活(huó)性
。
 

　　3. 在(zài)實(shí)驗(yàn)過程(chéng)中，需要(yào)充分消化組(zǔ)織以(yǐ)確保(bǎo)檢(jiǎn)測到(dào)足夠(gòu)數(shù)量(liáng)的細(xì)胞(bāo)
。
 

　　4. 同(tóng)時(shí)，也(yě)要盡可(kě)能充分去除成(chéng)纖(xiān)維(wéi)細胞
。
 

　　5. 在後續的培養(yǎng)過程中，必須保持(chí)全程(chéng)無(wú)菌操作，以(yǐ)確保培(péi)養環境(jìng)的(dí)純(chún)淨性
。
 

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