產品(pǐn)名稱(chēng)：abclonal愛(ài)博泰(tài)克(kè)SARS-CoV-2 ORF6抗體(A20324)現貨供應(yīng)

產品貨號：A20324

產(chǎn)品(pǐn)品(pǐn)牌(pái)：abclonal愛(ài)博(bó)泰(tài)克

產(chǎn)品(pǐn)背(bèi)景(jǐng)：嚴重急性(xìng)呼吸(xī)係統綜(zōng)合(hé)症(zhèng)冠(guān)狀病毒2（SARS-CoV-2）是一種包膜(mó)，正(zhèng)義(yì)，單鏈(liàn)RNA病毒，可引起(qǐ)2019年冠(guān)狀(zhuàng)病毒病。病毒顆粒包括侵襲(xí)宿主(zhǔ)細(xì)胞(bāo)所(suǒ)需(xū)的(dí)RNA遺(yí)傳(chuán)物(wù)質和結構(gòu)蛋白。一(yī)旦進(jìn)入(rù)細胞，感(gǎn)染RNA就被用來編(biān)碼(mǎ)構成病(bìng)毒(dú)顆(kē)粒(lì)的(dí)結(jié)構(gòu)蛋白，指導(dǎo)病(bìng)毒組(zǔ)裝(zhuāng)，轉(zhuǎn)錄，復製和宿主控(kòng)製(zhì)的非(fēi)結(jié)構蛋白，以及功能尚(shàng)未確定(dìng)的輔助(zhù)蛋(dàn)白(bái)~ORF6編(biān)碼病毒輔助蛋白。基(jī)於(yú)其與其他(tā)冠狀病(bìng)毒(dú)蛋白的相(xiāng)似(sì)性，ORF6蛋白被(bèi)認為(wéi)在(zài)病(bìng)毒發(fā)病機製中發(fā)揮作用(yòng)。

實驗方(fāng)案：蛋白質印(yìn)跡實驗：

1，樣品製(zhì)備

（1）細(xì)胞(bāo)收集

a. 貼壁培(péi)養細(xì)胞收集

用細胞刮刮下(xià)細(xì)胞(bāo)或用胰(yí)酶消化處(chǔ)理後，400×g，離心5 min，棄上清；用適量冰(bīng)PBS溶液將(jiāng)離(lí)心後細(xì)胞(bāo)沉(chén)澱(diàn)重懸，4℃，400×g 離心(xīn)5min,棄(qì)上清，重(zhòng)復(fù)清(qīng)洗步驟(zhòu)一(yī)次收(shōu)集細(xì)胞沉(chén)澱。

b. 懸(xuán)浮培(péi)養細(xì)胞收(shōu)集

收集(jí)懸(xuán)浮(fú)細(xì)胞，400×g離心5min，棄(qì)上(shàng)清，適量(liáng)冰PBS溶液將離(lí)心後細胞(bāo)沉(chén)澱(diàn)重懸(xuán)，4℃，400×g 離(lí)心5min,棄(qì)上清，重(zhòng)復清洗步驟一次，收(shōu)集細胞沉澱(diàn)。

c. 組(zǔ)織樣本(běn)收(shōu)集

把組(zǔ)織在預冷(lěng)的(dí)表(biǎo)麵上(shàng)剪(jiǎn)切(qiē)成(chéng)細小碎塊，然後用(yòng)液(yè)氮或超低溫(wēn)冰箱(xiāng)中冷凍(dòng)組(zǔ)織(zhī)30min以上，迅速加液(yè)氮研磨，研磨(mó)過(guò)程(chéng)盡量控製在1~2min之內，以減(jiǎn)少蛋白的(dí)降解(jiě)。

（2）總(zǒng)蛋白提取(qǔ)

a. 細胞/組織裂解(jiě)：

根據收集的(dí)細胞(bāo)數量，細胞(bāo)種(zhǒng)類添(tiān)加適(shì)量(liáng)的裂解液(yè)。

例如常規細(xì)胞(bāo)沉澱(diàn)可(kě)按照1mL裂(liè)解液/107個(gè)細胞(bāo)的比(bǐ)例加(jiā)入(rù)相應體積的裂解液，加(jiā)入裂解(jiě)液(yè)後將沉澱吹(chuī)打(dǎ)混匀。使用細胞破碎儀超(chāo)聲(shēng)樣(yàng)本，每次超(chāo)聲時(shí)間(jiān)4-5s,間隔(gé)時(shí)間(jiān)在(zài)5s左右(yòu)，肉眼(yǎn)觀察(chá)，樣本(běn)為均一(yī)，不粘(nián)稠液(yè)體(tǐ)即(jí)可(kě)。或(huò)采用震蕩(dàng)裂解(jiě)方(fāng)式(shì)進(jìn)行(háng)，每(měi)隔(gé)5min將離(lí)心管置於渦旋振(zhèn)蕩儀上震蕩(dàng)10s，裂解20min。

組織碎片可(kě)按照0.5mL 裂解液/100mg組織向(xiàng)匀漿(jiāng)器中(zhōng)加入(rù)蛋白裂(liè)解液(yè)，每3min研磨一(yī)次(cì)，重復5次，使組(zǔ)織(zhī)盡量碾碎(suì)（裂解(jiě)液(yè)中根據(jù)需要(yào)添加(jiā)或不添加蛋白酶抑(yì)製劑(jì)）。所(suǒ)有(yǒu)理解(jiě)過(guò)程，務必(bì)在低(dī)溫條(tiáo)件下進(jìn)行。

b. 離心(xīn)：

把裂(liè)解好的(dí)樣(yàng)品配平後(hòu)，將(jiāng)裂解好(hǎo)的樣(yàng)本(běn)置於(yú)預冷(lěng)的高(gāo)速冷凍離心機(jī)中(zhōng)，13000×g離(lí)心10min，收(shōu)集上清

c. 蛋(dàn)白(bái)變性(xìng)：

吸取少(shǎo)量蛋(dàn)白(bái)提取液做(zuò)蛋(dàn)白濃度測定。向剩餘(yú)的蛋白提取(qǔ)液(yè)的(dí)離心管(guǎn)中加入對應體(tǐ)積(jī)的(dí)5× Loading Buffer（最終工作(zuò)液(yè)為1×)，待幹式(shì)恒溫器(qì)溫(wēn)度升至(zhì)95℃後(hòu)，將(jiāng)1.5mL離心管插(chā)入加熱孔(kǒng)中，95℃加(jiā)熱(rè)變(biàn)性(xìng)10min，待液(yè)體(tǐ)冷卻後置於-20℃保(bǎo)存(cún)。

（3）蛋白(bái)濃(nóng)度(dù)測(cè)定（BCA法(fǎ)）

a. BCA工(gōng)作液的配(pèi)置

根據樣(yàng)品數量，按(àn)50體積(jī)BCA試劑(jì)A加入1體(tǐ)積(jī)BCA試劑B（50:1）配置(zhì)適量BCA工(gōng)作液，充(chōng)分混匀(yún)。BCA工(gōng)作(zuò)液室(shì)溫(wēn)24h內穩定。

b. BSA標準品梯度稀釋

取10μl蛋白標準品(pǐn)（5 mg/mL BSA）稀釋至(zhì)50μl，使終濃度為1mg/ml。稀(xī)釋(shì)後(hòu)的蛋白(bái)標準品(pǐn)可以-20℃長期保(bǎo)存。此(cǐ)標(biāo)準品溶液的稀(xī)釋液(yè)可(kě)使用(yòng)去(qù)離子水(shuǐ)或1×PBS。將標準(zhǔn)品按(àn)0，1，2，4，8，12，16，20μl加入到96孔(kǒng)板(bǎn)中，加(jiā)稀釋(shì)液(yè)補足到20μl。

c. 樣本(běn)濃度(dù)測定

加適當(dāng)體積(jī)樣品到(dào)96孔板的樣(yàng)品孔中，如果樣本不(bù)足20μl，需(xū)加(jiā)稀釋液(yè)補(bǔ)足到(dào)20μl。每(měi)孔加(jiā)入(rù) 200μl BCA工(gōng)作(zuò)液，37℃放(fàng)置20-30min。用(yòng)酶標儀(yí)測(cè)定(dìng)樣本和(hé)標準品在562nm下(xià)的吸(xī)光度，或(huò)在540-595nm之間波長下的(dí)吸(xī)光度。根(gēn)據BSA蛋白濃(nóng)度標準曲綫(xiàn)和(hé)使(shǐ)用(yòng)的樣品體(tǐ)積計算出樣品的蛋(dàn)白(bái)濃度。

2，凝(níng)膠(jiāo)電泳

（1）製膠器(qì)安(ān)裝(zhuāng)

根據使用(yòng)說明書安裝。

（2）凝膠(jiāo)配(pèi)置(zhì)

根(gēn)據目(mù)標(biāo)蛋白(bái)大小，選擇不(bù)同合適濃度(dù)的分(fēn)離(lí)膠（見(jiàn)附表(biǎo)）。注意該過程注(zhù)意不能有氣泡(pào)產生(shēng)。

（3）上樣

待膠(jiāo)凝固(gù)好(hǎo)後(hòu)，用(yòng)移(yí)液器吸(xī)取樣品垂直梳孔上樣，建(jiàn)議總(zǒng)蛋白(bái)上樣(yàng)量25ug/孔。注意內槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需(xū)注滿，外槽(cáo)Tris-Glycine SDS Running Buffer沒過底(dǐ)部3~5cm即可(kě)。

（4）電泳

上樣完(wán)成(chéng)後(hòu)，連通電(diàn)泳儀電(diàn)源，注(zhù)意正負(fù)極需連(lián)接正確(què)，設(shè)定適宜(yí)的(dí)電泳(yǒng)參數。建(jiàn)議(yì)濃(nóng)縮膠電(diàn)泳參(cān)數為恒壓80V，分離(lí)膠(jiāo)采(cǎi)用(yòng)恒(héng)壓120V。當溴(xiù)酚藍電泳到(dào)凝膠底部(bù)時，停止電(diàn)泳(yǒng)，關閉電(diàn)泳儀電源。

3，轉膜

（1）準備(bèi)工作(zuò)

a. 轉(zhuǎn)膜緩衝(chōng)液(yè)可提(tí)前2h （即(jí)開(kāi)始(shǐ)電泳後）放入(rù)-20℃冰箱預冷(lěng)。

b. 根據膠的(dí)麵(miàn)積(jī)大小，將濾(lǜ)紙以(yǐ)及(jí)NC膜(mó)剪裁(cái)至合(hé)適(shì)尺寸。

c. 建議目的蛋白(bái)大於20KD可選(xuǎn)擇0.45μm NC膜；目的(dí)蛋(dàn)白小(xiǎo)於20KD可選擇0.2μm的(dí)NC膜(mó)或0.22μm的(dí)PVDF膜。選(xuǎn)擇(zé)完畢後將膜(mó)放(fàng)在(zài)Western Transfer Buffer中(zhōng)浸(jìn)泡備(bèi)用(yòng)。注意(yì)使用PVDF膜(mó)需(xū)先放入(rù)甲(jiǎ)醇中浸(jìn)泡(pào)1min左(zuǒ)右(yòu)至均匀浸透(tòu)，沒(méi)有白點(diǎn)即可放入Western Transfer Buffer中浸泡備用。

（2）轉膜

根據(jù)目的(dí)蛋白大(dà)小，選擇合適的轉膜條件（見(jiàn)附表）。

4，封閉

轉膜(mó)完(wán)成後，將(jiāng)膜取(qǔ)出，放入合(hé)適的抗(kàng)體孵育(yù)槽(cáo)中，加(jiā)入(rù)Western Blocking Buffer 室(shì)溫孵(fū)育(yù)1h，加入TBST Buffer洗(xǐ)滌(dí)3次，每次5 min。

5，抗體(tǐ)孵育

根據所(suǒ)使(shǐ)用的一抗(kàng)種類，選擇(zé)進行(háng)下(xià)述其(qí)中1項的具體步驟

（1）對(duì)於(yú)無(wú)偶聯的(dí)一(yī)抗(kàng)

a. 將一(yī)抗(kàng)用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照(zhào)抗體(tǐ)說明書推(tuī)薦比(bǐ)例(lì)進(jìn)行稀釋(shì),室溫(wēn)孵育1.5h或4℃過(guò)夜(yè)孵(fū)育。

b. TBST Buffer洗滌4次(cì)，每(měi)次5 min。

c. 按(àn)一抗(kàng)來源(yuán)選取(qǔ)合(hé)適的HRP偶(ǒu)聯二(èr)抗，按照合適(shì)比(bǐ)例(lì)進(jìn)行(háng)稀釋，室(shì)溫(wēn)孵(fū)育1h。

d. TBST Buffer洗滌4次，每(měi)次(cì)5 min。

e. 繼續進(jìn)行(háng)後續(xù)曝光(guāng)操作(zuò)。

（2）對(duì)於偶聯(lián)有HRP的一(yī)抗

a. 將一(yī)抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗(kàng)體(tǐ)說明書推(tuī)薦(jiàn)比例進(jìn)行稀釋,室(shì)溫(wēn)孵育1.5h或4℃過(guò)夜(yè)孵育(yù)。

b. 用TBST Buffer洗滌4次(cì)，每次(cì)5 min。

c. 繼續進行(háng)後續曝光(guāng)操(cāo)作(zuò)。

6，曝光(guāng)

a. 吸取等體積ECL SolutionⅠ和(hé)SolutionⅡ混(hùn)匀(yún)，配製(zhì)成發光檢(jiǎn)測(cè)工作液。推(tuī)薦用(yòng)量為每(měi)10cm2的膜使用1-2 mL發光檢測(cè)工(gōng)作液(yè)即(jí)可。

b. 用鑷(niè)子將膜(mó)取(qǔ)出，膜的下緣(yuán)輕輕接(jiē)觸吸(xī)水紙，去(qù)除膜上多(duō)餘的液體。用移(yí)液槍吸(xī)取(qǔ)工(gōng)作液並(bìng)均(jūn)匀覆(fù)蓋轉印膜，室溫孵育 1-2 minutes，此(cǐ)步驟可在潔淨(jìng)保(bǎo)鮮(xiān)膜上或塑(sù)料盒(hé)中(zhōng)完成。

c. 獲取(qǔ)WB結果(guǒ)：

1) 傳統(tǒng)壓片(piàn)曝光顯(xiǎn)影(yǐng)：將(jiāng)膜固(gù)定(dìng)於片(piàn)夾(jiā)內。暗(àn)室內壓片(piàn)1分鐘，立(lì)即顯影(yǐng)定(dìng)影，根(gēn)據結(jié)果(guǒ)再調(tiáo)整(zhěng)壓片時(shí)間獲取最佳信噪(zào)比(bǐ)圖(tú)片(piàn)。或直接(jiē)分(fēn)別壓片 30 秒，1，3，5分(fēn)鐘，然(rán)後一起顯影(yǐng)定影(yǐng)觀察(chá)結(jié)果(guǒ)。

2) 化學發光(guāng)成像(xiàng)儀獲取電子(zǐ)圖(tú)片：將膜放(fàng)置(zhì)到成像儀(yí)內，參考(kǎo)儀(yí)器(qì)說明(míng)書設置合適的(dí)參數以獲取優化(huà)圖片(piàn)。同(tóng)時應(yīng)根據靶(bǎ)蛋(dàn)白(bái)的(dí)生(shēng)物學性質如(rú)豐(fēng)度(dù)等(děng)來(lái)調(tiáo)節(jié)成像參數(shù)。

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