產品名稱：碧(bì)雲天(tiān)beyotime酵(jiào)母(mǔ)質(zhì)粒小(xiǎo)量抽提試劑(jì)盒(D0029)現貨(huò)供(gōng)應(yīng)

產品(pǐn)貨號(hào)：D0029

產品品牌(pái)：碧雲(yún)天(tiān)beyotime

使用方(fāng)法：

1.取培養過(guò)夜的酵母1.5毫升(shēng)，5000g離(lí)心(xīn)1分鐘(zhōng)收集(jí)酵(jiào)母沉澱(diàn)，棄上(shàng)清(qīng)。再重復(fù)一次(cì)，每(měi)管共(gòng)收集3毫升培養過(guò)夜的(dí)酵母。再在離心機快速離心一下(5000g離(lí)心(xīn)1-2秒)，用(yòng)移(yí)液器小心吸盡殘(cán)餘(yú)液體(tǐ)。

通常酵母(mǔ)宜30°C培(péi)養(yǎng)過夜(16-24小時(shí)左右(yòu))。建議5000g(～5000-6000rpm)室(shì)溫離心(xīn)1分(fēn)鐘，如沉(chén)澱(diàn)不充分則(zé)適當延長離心(xīn)時(shí)間。時(shí)間過長或(huò)離(lí)心(xīn)速度過(guò)快(kuài)會使(shǐ)沉(chén)澱(diàn)過(guò)於(yú)緊密，不利(lì)於後續加入(rù)溶液I後(hòu)充分重懸(xuán)沉澱。直接倒掉上(shàng)清，再倒(dǎo)入(rù)約1.5毫(háo)升酵母液並重復上(shàng)述的(dí)離心(xīn)操作，然(rán)後(hòu)直(zhí)接倒掉上(shàng)清(qīng)，再在(zài)離心機(jī)快(kuài)速離(lí)心一下(5000g 1-2秒(miǎo))，用移(yí)液(yè)器(qì)小(xiǎo)心(xīn)吸(xī)盡(jìn)殘(cán)餘(yú)液(yè)體。殘(cán)餘液(yè)體必須(xū)吸盡，否(fǒu)則可(kě)能會幹(gān)擾後續的酶解(jiě)反應。如(rú)果酵母(mǔ)密(mì)度明顯偏(piān)低，可(kě)考慮使用更(gēng)多(duō)酵(jiào)母液(yè)，再重(zhòng)復上述(shù)操(cāo)作1-2次(cì)。所用(yòng)酵(jiào)母量一(yī)般(bān)不(bù)宜超過5ml。過量的酵母(mǔ)會(huì)導致後(hòu)續(xù)的酶解(jiě)和鹼(jiǎn)裂解不(bù)充(chōng)分(fēn)。

2.每(měi)管(guǎn)加入100微升酶(méi)解緩衝(chōng)液，重(zhòng)懸酵母(mǔ)沉(chén)澱。確(què)保沉澱(diàn)散開，無可見(jiàn)酵母(mǔ)團塊。

可以通(tōng)過(guò)劇烈Vortex來(lái)重(zhòng)懸(xuán)沉澱。

3.加入20微(wēi)升(shēng)配製好(hǎo)的(dí)Lyticase溶液，充(chōng)分混(hùn)匀(yún)，30℃水(shuǐ)平搖床200-250rpm孵育(yù)0.5-1小時(shí)。

注意(yì)：根(gēn)據(jù)酵(jiào)母菌株和(hé)酵母(mǔ)細(xì)胞(bāo)數量的不同，酶解的(dí)孵育時(shí)間可(kě)進行適(shì)當調整(zhěng)。當(dāng)酵(jiào)母(mǔ)用量(liáng)較大時，酶解的孵(fū)育時間(jiān)需延(yán)長(cháng)。孵育(yù)時(shí)間(jiān)延長(cháng)到2-3小時通常(cháng)不會(huì)對質粒抽提帶(dài)來(lái)負麵(miàn)影(yǐng)響(xiǎng)。

4.1500g (～3000-4000rpm)離心10分(fēn)鐘，棄上清(qīng)，收集(jí)沉(chén)澱(diàn)。

直(zhí)接倒掉(diào)上(shàng)清，然後(hòu)倒(dǎo)置(zhì)於吸水(shuǐ)紙(zhǐ)上(可(kě)用(yòng)普通草(cǎo)紙)，使液體流盡(jìn)。也(yě)可在直接倒掉上清後再在(zài)離(lí)心機內甩一下(xià)，用移液(yè)器吸盡(jìn)殘留液體(tǐ)。不同(tóng)離心機(jī)因離(lí)心半價的(dí)不同g和rpm的(dí)換(huàn)算值(zhí)有(yǒu)所不同。

5.每管(guǎn)加(jiā)入(rù)250微升溶液I，重懸酵(jiào)母沉澱。確保沉澱散(sàn)開(kāi)，無可見酵母團(tuán)塊。

確(què)認溶(róng)液I中已(yǐ)經添加了RNase A。由於此時酵母細(xì)胞壁(bì)已(yǐ)經(jīng)去除(chú)，重(zhòng)懸操作要(yào)溫(wēn)和(hé)，不宜劇烈振蕩，否則(zé)會(huì)容(róng)易導(dǎo)致(zhì)基(jī)因組DNA的汙染。但(dàn)同時必(bì)須(xū)保證(zhèng)沉澱充分(fēn)散(sàn)開，即必(bì)須確(què)保(bǎo)酵母(mǔ)細(xì)胞(bāo)充(chōng)分分散到溶液(yè)中(zhōng)。

6.每(měi)管加(jiā)入250微升溶液II，輕(qīng)輕顛(diān)倒離(lí)心管4-6次，使菌體(tǐ)裂解，溶液(yè)透(tòu)明。

切勿vortex！vortex或(huò)其它(tā)劇烈(liè)操作會(huì)導致基因組DNA斷裂，易導致最(zuì)終所(suǒ)得(dé)質(zhì)粒被(bèi)基(jī)因組(zǔ)DNA汙染(rǎn)。遇到(dào)有少量團塊或絮狀(zhuàng)物(wù)產生(shēng)的(dí)情況，可(kě)以(yǐ)增加顛倒次(cì)數(shù)3-5次(cì)，再(zài)室溫(wēn)放(fàng)置2-3分鐘，但(dàn)總(zǒng)裂解時(shí)間(jiān)不(bù)可超過5分鐘。

7.每管(guǎn)加入(rù)350微升(shēng)溶液III，隨(suí)即顛(diān)倒離心管4-6次混匀(yún)，可(kě)見白色(sè)絮狀物(wù)產生。

切勿vortex！顛(diān)倒次數也(yě)不宜(yí)過(guò)多，否(fǒu)則易導(dǎo)致最(zuì)終所得質粒的質量下(xià)降。

8.最(zuì)高速(13,000rpm左右)室溫離(lí)心10分鐘。

離(lí)心後會產(chǎn)生白色(sè)沉(chén)澱。離(lí)心時準(zhǔn)備好(hǎo)下一步(bù)需使(shǐ)用的質粒純(chún)化柱(zhù)，廢液收集管(guǎn)，並在純化(huà)柱(zhù)上做好標記。

9.將上(shàng)一(yī)步驟(zhòu)離心(xīn)後的(dí)上清倒(dǎo)入或(huò)吸入到質粒純化(huà)柱內。最高速(sù)離心30-60秒，倒(dǎo)棄收集管(guǎn)內(nèi)液(yè)體(tǐ)。

質粒(lì)倒入(rù)質粒(lì)純化柱後，可(kě)以不用等(děng)待，直(zhí)接離心。倒棄收集管內(nèi)的(dí)液體後，保留收集管(guǎn)繼(jì)續(xù)使(shǐ)用。

10.在(zài)質(zhì)粒(lì)純(chún)化柱(zhù)內(nèi)加(jiā)入750微(wēi)升(shēng)溶液(yè)IV，最高(gāo)速(sù)離心30-60秒(miǎo)，洗(xǐ)去(qù)雜質，倒(dǎo)棄(qì)收集(jí)管內(nèi)液(yè)體。

加(jiā)入溶液(yè)IV後可(kě)以不(bù)用等待，直(zhí)接離心。倒棄(qì)收(shōu)集管內(nèi)的液體(tǐ)後(hòu)，保留(liú)收集(jí)管(guǎn)繼(jì)續(xù)使用(yòng)。

11.最高速再離心1分鐘，除(chú)去(qù)殘(cán)留液體(tǐ)並(bìng)使痕量乙(yǐ)醇(chún)揮發(fā)。

注意(yì)：倒(dǎo)棄收(shōu)集(jí)管內(nèi)液體(tǐ)後(hòu)再離心，才能去除(chú)微量(liáng)的(dí)溶液IV。微量(liáng)的溶(róng)液IV會影(yǐng)響質粒(lì)的質(zhì)量。

12.將質粒(lì)純化柱置於1.5毫升離(lí)心管上(shàng)，加(jiā)入50微(wēi)升(shēng)溶液V至(zhì)管內(nèi)柱麵(miàn)上，放置1分鐘(zhōng)。

溶(róng)液V需(xū)要直接加(jiā)至(zhì)管(guǎn)內(nèi)柱麵(miàn)中(zhōng)央，使(shǐ)液體被(bèi)純(chún)化柱(zhù)吸收(shōu)。如果不慎(shèn)將(jiāng)溶(róng)液(yè) V沾(zhān)在管(guǎn)壁(bì)上，一定(dìng)要(yào)震動管子，使(shǐ)液(yè)體滑(huá)落(là)到管底，以(yǐ)便(biàn)被純化柱吸(xī)收(shōu)。也(yě)可(kě)以(yǐ)用重蒸(zhēng)水(shuǐ)或 Milli-Q級(jí)純水替代溶液(yè)V，但是水(shuǐ)的pH應不小(xiǎo)於6.5。溶液V加入後(hòu)放置時(shí)間稍長，對(duì)於(yú)增加質粒產量(liáng)會略有(yǒu)幫(bāng)助(zhù)。

13. 最(zuì)高(gāo)速(sù)離(lí)心1分(fēn)鐘，所得液體(tǐ)即(jí)為高純度(dù)酵母質粒。

相關文獻：

[1]Wang M, Wang L, Guo Y, Sun R, Yue F, Yi Q, Song L. . The broad pattern recognition spectrum of the Toll-like receptor in mollusk Zhikong scallop Chlamys farreri. Dev Comp Immunol. 2015 Oct;52(2):192-201. (IF 3.192);

[2]Wang Z, Yu X, Niu X, Yang J, Tang Y, Hu J, Diao Y . Screening of the proteins interacting with NS1 of TMUV by yeast two-hybrid system and the identification of the function of the interacted protein. Infect Genet Evol. 2018 Sep;63:277-284. (IF 2.773);

[3]Wang Y, Zhang S, Tang Y, Diao Y . Screening of Duck Tembusu Virus NS3 Interacting Host Proteins and Identification of Its Specific Interplay Domains. VIRUSES-BASEL. 2019 Aug 12 11(8). pii: E740. (IF 3.816);

[4]Hui Wang, Wenrui Zhang, Rujiao Liu, Jiaoyun Zheng, Xueping Yao, Hui Chen, Jie Wang, Horst Christian Weber, Xiaoqun Qin, Yang Xiang, Chi Liu, Huijun Liu, Lang Pan, Xiangping Qu . Lack of bombesin receptor-activated protein attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice Life Sci Alliance. 2022 Jul 12;5(11):e202201368. doi: 10.26508/lsa.202201368.

歡迎(yíng)訂購(gòu)：

天津益(yì)元(yuán)利(lì)康(kāng)生(shēng)物科技有(yǒu)限公司現貨供應碧(bì)雲天beyotime酵母(mǔ)質粒(lì)小量抽提試劑(jì)盒(D0029)，歡迎選(xuǎn)購(gòu)！