產品(pǐn)名稱(chēng)：碧(bì)雲天beyotime綫粒(lì)體(tǐ)膜電(diàn)位(wèi)與細胞凋亡檢(jiǎn)測(cè)試劑盒(hé)(C1071M)現(xiàn)貨供應

產品貨號：C1071M

產(chǎn)品品牌：碧(bì)雲天beyotime

使(shǐ)用(yòng)方法(fǎ)：

1. 對於(yú)懸浮細胞(bāo)：

a. 在進行完(wán)細(xì)胞凋(diāo)亡(wáng)刺激後，1000g離心(xīn)5分鐘，棄上清(qīng)，收集細胞(bāo)，用PBS輕輕重懸細胞(bāo)並計數(shù)。注意：PBS重懸(xuán)不能省略，PBS重懸的過程同時也起(qǐ)到(dào)了洗滌(dí)細(xì)胞的作用，可以保證後(hòu)續Annexin V-FITC的結合。

b. 取5-10萬重(zhòng)懸(xuán)的細胞，1000g離心5分鐘(zhōng)，棄上清，加(jiā)入188μl Annexin V-FITC結合(hé)液(yè)輕(qīng)輕重(zhòng)懸細胞。

c. 加入(rù)2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液(yè)，5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混(hùn)匀(yún)。注意(yì)：Hoechst 33342染色液可(kě)以選擇性加(jiā)入，不(bù)加入(rù)也是(shì)可以的。

d. 室(shì)溫(wēn)(20-25℃)避(bì)光孵育(yù)20-30分(fēn)鐘(zhōng)，隨後(hòu)置於冰(bīng)浴中(zhōng)。可以使用鋁箔(bó)進行(háng)避光(guāng)。孵育(yù)過(guò)程(chéng)中可以重(zhòng)懸(xuán)細胞(bāo)2-3次以(yǐ)改善染(rǎn)色效(xiào)果(guǒ)。

e. 如(rú)果用於流式細胞(bāo)儀(yí)檢測，可立(lì)即上(shàng)機(jī)檢(jiǎn)測，Mito-Tracker Red CMXRos為(wéi)紅色熒(yíng)光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為(wéi)綠色熒(yíng)光(guāng)(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍(lán)色熒(yíng)光(guāng)(Ex/Em:350/461nm)，很(hěn)多(duō)時候(hòu)流(liú)式檢測(cè)僅(jǐn)檢(jiǎn)測紅(hóng)色和(hé)綠色熒(yíng)光即(jí)可，也(yě)可以同時檢(jiǎn)測紅(hóng)綠(lǜ)藍(lán)三(sān)色(sè)熒光。如果(guǒ)用於熒(yíng)光(guāng)顯(xiǎn)微鏡(jìng)檢(jiǎn)測，1000g離(lí)心5分(fēn)鐘，收(shōu)集細胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合(hé)液輕輕重(zhòng)懸(xuán)細胞(bāo)，塗(tú)片後(hòu)，熒(yíng)光顯微(wēi)鏡(jìng)下觀(guān)察(chá)。

注意：細(xì)胞在染(rǎn)色後須盡(jìn)快完成(chéng)檢測，通(tōng)常宜在1小(xiǎo)時之(zhī)內(nèi)完成檢(jiǎn)測；熒(yíng)光(guāng)探針(zhēn)的濃(nóng)度(dù)可以根(gēn)據具(jù)體(tǐ)的染(rǎn)色(sè)效(xiào)果進行(háng)適(shì)當調整，以(yǐ)獲得(dé)更好(hǎo)的染(rǎn)色效(xiào)果(guǒ)；熒光顯微(wēi)鏡(jìng)檢測或流(liú)式(shì)細胞儀檢(jiǎn)測時(shí)，都可以不加(jiā)入Hoechst 33342染色(sè)液。

2. 對於貼壁細胞(bāo)的消(xiāo)化後檢測：

a. 把(bǎ)細(xì)胞培養液吸(xī)出(chū)至一合(hé)適離(lí)心(xīn)管內(nèi)，PBS洗(xǐ)滌(dí)貼壁(bì)細(xì)胞一次，加(jiā)入適量胰(yí)酶(méi)細胞(bāo)消(xiāo)化(huà)液(可(kě)含有EDTA)消化(huà)細胞(bāo)。室(shì)溫(wēn)孵育至(zhì)輕(qīng)輕吹(chuī)打可以使貼壁細胞吹打下(xià)來(lái)時，吸除(chú)胰酶細(xì)胞消化液。需避免(miǎn)胰(yí)酶的過(guò)度(dù)消(xiāo)化(huà)。

注意(yì)：對於(yú)貼壁(bì)細(xì)胞(bāo)，胰酶(méi)消化步驟(zhòu)很(hěn)關鍵。胰(yí)酶消化時間如(rú)果(guǒ)過短(duǎn)，細胞(bāo)需要用(yòng)力吹(chuī)打(dǎ)才能(néng)脫落，容易造(zào)成(chéng)細胞(bāo)膜的損(sǔn)傷(shāng)；消化時間如果過長(cháng)，同樣(yàng)易造(zào)成細(xì)胞膜損傷，甚至(zhì)會影響細胞(bāo)膜上磷脂酰(xiān)絲(sī)氨(ān)酸與(yǔ)Annexin V-FITC的結(jié)合從而幹擾(rǎo)對(duì)於細胞(bāo)凋亡(wáng)的(dí)檢測。同時(shí)，胰(yí)酶細胞消化(huà)液中應盡量不(bù)含(hán)EDTA，因(yīn)為EDTA可能會(huì)影(yǐng)響(xiǎng)Annexin V與(yǔ)磷(lín)脂(zhī)酰(xiān)絲氨酸(suān)的結合(hé)。

b. 加(jiā)入步(bù)驟2a中(zhōng)收(shōu)集的(dí)細(xì)胞(bāo)培養(yǎng)液，稍混匀(yún)，轉移(yí)到離心(xīn)管內(nèi)，1000g離心5分鐘(zhōng)，棄上清(qīng)，收集(jí)細胞，用(yòng)PBS輕輕(qīng)重懸細(xì)胞並計數。注(zhù)意：加(jiā)入步(bù)驟(zhòu)2a中(zhōng)的(dí)細胞培養液(yè)一(yī)方(fāng)麵(miàn)可以收集(jí)已經懸(xuán)浮的發生凋亡(wáng)或(huò)壞死的(dí)細(xì)胞(bāo)，另(lìng)一(yī)方(fāng)麵(miàn)細胞(bāo)培養(yǎng)液(yè)中(zhōng)的(dí)血(xiě)清可以(yǐ)有(yǒu)效(xiào)抑製或(huò)中(zhōng)和殘留的胰(yí)酶(méi)；殘留的(dí)胰酶(méi)會(huì)消化(huà)並降(jiàng)解後續(xù)加入的(dí)Annexin V-FITC導(dǎo)致(zhì)染色失敗。

c. 取(qǔ)5-10萬重懸(xuán)的細胞，1000g離(lí)心(xīn)5分(fēn)鐘(zhōng)，棄(qì)上(shàng)清(qīng)，加(jiā)入188μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕(qīng)輕重懸細(xì)胞(bāo)。

d. 加入(rù)2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色(sè)液，5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染(rǎn)色(sè)液，輕(qīng)輕混匀。注(zhù)意：Hoechst 33342染色液可(kě)以(yǐ)選(xuǎn)擇(zé)性加入(rù)，不(bù)加入也是(shì)可(kě)以的(dí)。

e. 室(shì)溫(20-25℃)避光孵(fū)育20-30分鐘，隨(suí)後置於(yú)冰浴(yù)中。可(kě)以使(shǐ)用(yòng)鋁(lǚ)箔進行避光。孵育過程(chéng)中(zhōng)可以(yǐ)重懸(xuán)細胞2-3次以改善染(rǎn)色效果。

f. 如(rú)果(guǒ)用於流式(shì)細(xì)胞儀(yí)檢測，可立即(jí)上(shàng)機(jī)檢測，Mito-Tracker Red CMXRos為紅(hóng)色(sè)熒光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為綠色熒光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍(lán)色(sè)熒光(Ex/Em:350/461nm)，很(hěn)多時候(hòu)流式(shì)檢測(cè)僅(jǐn)檢(jiǎn)測紅(hóng)色和綠色熒光(guāng)即可，也(yě)可(kě)以同時(shí)檢(jiǎn)測紅綠(lǜ)藍(lán)三色熒光。如果(guǒ)用於熒光顯微(wēi)鏡檢測(cè)，1000g離(lí)心(xīn)5分鐘(zhōng)，收集細胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合(hé)液(yè)輕輕(qīng)重懸(xuán)細(xì)胞(bāo)，塗(tú)片後(hòu)，熒光顯(xiǎn)微鏡下觀察(chá)。

注意(yì)：細胞在染色(sè)後須(xū)盡快完成(chéng)檢測(cè)，通常宜在1小(xiǎo)時(shí)之(zhī)內(nèi)完成檢測；熒光探(tàn)針的濃度可(kě)以根據(jù)具(jù)體的染(rǎn)色效果(guǒ)進行適當(dāng)調整，以獲(huò)得更(gēng)好的染(rǎn)色效(xiào)果(guǒ)；熒(yíng)光顯微(wēi)鏡檢(jiǎn)測或流式細胞(bāo)儀(yí)檢(jiǎn)測(cè)時，都(dū)可以不加入(rù)Hoechst 33342染(rǎn)色液。

3. 對於貼(tiē)壁(bì)細(xì)胞(bāo)的原(yuán)位熒光(guāng)檢測：

注：本方法(fǎ)的(dí)優點(diǎn)是(shì)可(kě)以原(yuán)位(wèi)觀(guān)察細(xì)胞(bāo)凋(diāo)亡(wáng)，缺點是(shì)部(bù)分(fēn)凋(diāo)亡由於不貼壁而檢測(cè)不到。

a. (選(xuǎn)做)如果條件許可(kě)，把細(xì)胞培(péi)養於24孔(kǒng)板(bǎn)，48孔(kǒng)板或(huò)96孔板內。在凋(diāo)亡(wáng)誘導結(jié)束後，用可以對多孔板進行離心的(dí)離(lí)心(xīn)機1000g離心5分(fēn)鐘(zhōng)。

b. 吸除(chú)細胞培(péi)養液(yè)，加入(rù)PBS洗滌一(yī)次。

c. 加(jiā)入188µl Annexin V-FITC結合液(yè)。

d. 加(jiā)入5µl Annexin V-FITC，輕(qīng)輕(qīng)混匀。

e. 加入(rù)2µl Mito-Tracker Red CMXRos染(rǎn)色(sè)液和(hé)5μl Hoechst 33342染色(sè)液(yè)，輕輕混匀(yún)。注意(yì)：Hoechst 33342染色(sè)液可(kě)以(yǐ)選(xuǎn)擇性加入，不(bù)加(jiā)入(rù)也(yě)是(shì)可(kě)以的(dí)。

f. 室(shì)溫(20-25℃)避光(guāng)孵育20-30分(fēn)鐘，隨(suí)後置於冰浴中。可以使用鋁箔進行(háng)避光。

g. 隨(suí)即(jí)在熒(yíng)光(guāng)顯(xiǎn)微鏡下觀察(chá)，Mito-Tracker Red CMXRos為(wéi)紅色(sè)熒光(guāng)，Annexin V-FITC為綠色熒光，Hoechst 33342為藍色(sè)熒光。

注意(yì)：細(xì)胞在(zài)染色後(hòu)須(xū)盡快(kuài)完(wán)成(chéng)檢測(cè)，通常宜(yí)在(zài)1小(xiǎo)時之內完成(chéng)檢(jiǎn)測。熒(yíng)光顯微鏡(jìng)檢(jiǎn)測(cè)時，也可(kě)以不加入Hoechst 33342染色(sè)液。

相(xiāng)關(guān)文(wén)獻：

[1]Tingting Liu, Cheng Jiang, Liying Zhu, Ling Jiang, He Huang. Fe 3 O 4@chitosan Microspheres Coating as Cytoprotective Exoskeletons for the Enhanced Production of Butyric Acid With Clostridium tyrobutyricum Under Acid Stress Front Bioeng Biotechnol. 2020 May 15;8:449. doi: 10.3389/fbioe.2020.00449.

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