質(zhì)粒最早是(shì)20世紀50年(nián)代初(chū)期(qī)在大腸杆(gān)菌(jūn)中(zhōng)發現的，是(shì)細菌，酵母菌(jūn)，放(fàng)綫菌等生物中獨(dú)立於染色(sè)體(或擬核)以(yǐ)外(wài)的(dí)閉(bì)合環狀雙鏈DNA分子(zǐ)，具(jù)有自(zì)主復(fù)製能(néng)力，可(kě)在子代細(xì)胞(bāo)中(zhōng)保(bǎo)持恒定(dìng)的拷貝數，並表(biǎo)達(dá)所(suǒ)攜帶的(dí)遺傳信息。那(nà)麼你知道影響質粒(lì)構(gòu)建(jiàn)實驗(yàn)的因(yīn)素(sù)有(yǒu)什麼(mó)嗎
？讓我們一起(qǐ)來看(kàn)看吧！
 

　　一，載(zǎi)體(tǐ)的(dí)選擇
 

　　在(zài)選(xuǎn)取克隆(lóng)載體時應留意(yì)以下幾(jī)點：
 

　　①具備自主復(fù)製能力(lì)，拷(kǎo)貝數(shù)量(liáng)眾多；
 

　　②攜(xié)帶易於篩(shāi)選(xuǎn)的選擇(zé)標記；
 

　　③含有(yǒu)多種(zhǒng)限(xiàn)製酶(méi)識(shí)別序列，以供外(wài)源基因(yīn)插入；
 

　　二，引(yǐn)物(wù)設(shè)計留(liú)意事(shì)項(xiàng)
 

　　在構建質粒(lì)時，設(shè)計引物時應考慮(lǜ)引(yǐn)物長(cháng)度，引物的(dí)GC含(hán)量(liáng)，引物(wù)的Tm值等因素，並避免(miǎn)引物(wù)間出現(xiàn)配對(duì)突變(biàn)或次級(jí)結構等情(qíng)況。
 

　　前向引(yǐn)物：5’端(duān)–上遊克隆載(zǎi)體末(mò)端同源序(xù)列 + 基因正(zhèng)向擴增(zēng)引物 --3’端
 

　　反向引物：3’端–基(jī)因(yīn)反向擴(kuò)增(zēng)引物(wù) + 下(xià)遊(yóu)克隆載(zǎi)體末(mò)端同(tóng)源(yuán)序(xù)列(liè) --5’端(duān)
 

　　在運用(yòng)PCR擴增目(mù)的基因的過程中(zhōng)，引物設計需留意(yì)事(shì)項(xiàng)：
 

　　① 引物長(cháng)度最好在18-30bp左(zuǒ)右，常(cháng)用的(dí)長度是 20-22bp；
 

　　②引物 Tm 值最好在(zài) 60℃ 左右(yòu)，兩(liǎng)條引物間 Tm 值(zhí)要(yào)保持接(jiē)近(jìn)，相(xiāng)差最好(hǎo)不要超過 5°C；
 

　　③GC 的(dí)含(hán)量標準通常(cháng)為(wéi) 40%-60% 或45-55%；
 

　　三，酶切(qiē)位(wèi)點(diǎn)的選(xuǎn)擇
 

　　在(zài)構建質粒(lì)時，選(xuǎn)擇(zé)適當的(dí)切(qiē)割酶(méi)和連(lián)接酶至關重要(yào)。對於(yú)切割(gē)酶的選擇，應該考(kǎo)慮到(dào)酶切位點的(dí)位置以及酶的反應(yīng)條件(jiàn)等因(yīn)素(sù)。而(ér)對(duì)於(yú)連(lián)接酶的選擇(zé)，則應根據(jù)所使(shǐ)用(yòng)的質粒(lì)載(zǎi)體和(hé)目標基因(yīn)的大(dà)小(xiǎo)來確定。
 

　　①選擇(zé)質粒上兩個(gè)酶切位點之間(jiān)的(dí)距(jù)離不宜(yí)過小(>10bp)，否則(zé)會影響限(xiàn)製(zhì)性內切酶(méi)對(duì)切(qiē)點的識別，從(cóng)而不(bù)利於空載(zǎi)體(tǐ)的雙重酶切。
 

　　②在克(kè)隆(lóng)表(biǎo)達(dá)目(mù)的(dí)基因(yīn)的(dí)情況(kuàng)下(xià)，選(xuǎn)擇酶切(qiē)位點(diǎn)時應考(kǎo)慮以下(xià)因素(sù)：
 

　　目標基(jī)因片段(duàn)內(nèi)不應含(hán)有(yǒu)所選(xuǎn)酶(méi)切(qiē)位(wèi)點(否則在檢驗陽性(xìng)重組(zǔ)子的雙(shuāng)重(zhòng)酶切時可能會(huì)切斷(duàn)目標基因)。
 

　　③在後(hòu)續實驗(yàn)中使用的所有(yǒu)載體(tǐ)(真(zhēn)核，原核，酵母(mǔ)，昆蟲(chóng))盡可能(néng)含(hán)有所選的酶(méi)切(qiē)位點，並(bìng)且(qiě)要確保插(chā)入載體時(shí)的方(fāng)向正(zhèng)確(即定向(xiàng)克隆(lóng))，以(yǐ)免(miǎn)在(zài)更(gēng)換(huàn)載體進(jìn)行表達時(shí)需(xū)要重(zhòng)新設(shè)計(jì)引物以(yǐ)引入(rù)新的(dí)酶(méi)切位點。
 

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