一，前言

蛋白(bái)質印(yìn)跡(jì)法（Western Blot）通過特(tè)異(yì)性抗(kàng)體對凝膠(jiāo)電(diàn)泳(yǒng)處理過的(dí)細(xì)胞或生物(wù)組織樣品(pǐn)進行著色(sè)，通過分析著色的(dí)位(wèi)置和(hé)著色深(shēn)度(dù)獲(huò)得(dé)特定(dìng)蛋白(bái)質在(zài)所分(fēn)析(xī)的細(xì)胞(bāo)或組織(zhī)中表達情(qíng)況的分子生(shēng)物學技(jì)術
。Western Blotting實(shí)驗單層貼(tiē)壁細(xì)胞(bāo)總蛋白的提取步驟(zhòu)
：

二(èr)，操作步(bù)驟(zhòu)

1. 1. 倒掉培養(yǎng)液，並(bìng)將瓶倒(dǎo)扣在(zài)吸(xī)水(shuǐ)紙上使(shǐ)吸水紙(zhǐ)吸(xī)幹培養液（或將瓶直立放置(zhì)一會兒使(shǐ)殘餘培養(yǎng)液(yè)流(liú)到(dào)瓶底(dǐ)然後再(zài)用移(yí)液(yè)器將其吸走）
   。

2. 2. 每瓶細胞加3ml 4℃預冷(lěng)的(dí)PBS（0.01M pH=7.2～7.3）
   。平(píng)放輕輕(qīng)搖(yáo)動(dòng)1min洗滌(dí)細(xì)胞，然後棄(qì)去洗液(yè)
   。重復以上(shàng)操(cāo)作兩次，共(gòng)洗細胞(bāo)三(sān)次(cì)以洗(xǐ)去培(péi)養液
   。將PBS棄淨後把培(péi)養(yǎng)瓶(píng)置於(yú)冰上
   。

3. 3. 按1ml裂解液(yè)加10μl PMSF（100mM），搖匀置於冰(bīng)上
   。（PMSF要搖(yáo)匀至無結晶時才可(kě)與裂解液混(hùn)合
   。）

4. 4. 每瓶(píng)細胞加(jiā)400μl含PMSF的裂解液，於冰(bīng)上裂解(jiě)30min，為使細(xì)胞充分(fēn)裂(liè)解培養瓶要經常來(lái)回搖動(dòng)
   。

5. 5. 裂解完後，用(yòng)幹(gān)淨(jìng)的刮棒(bàng)將(jiāng)細胞刮於(yú)培養(yǎng)瓶(píng)的(dí)一側(cè)（動(dòng)作(zuò)要快(kuài)），然(rán)後用(yòng)槍(qiāng)將細(xì)胞碎(suì)片(piàn)和裂解(jiě)液移至(zhì)1.5ml離(lí)心管中
   。（整(zhěng)個(gè)操作盡(jìn)量(liáng)在(zài)冰(bīng)上進(jìn)行
   。）

6. 6. 於4℃下(xià)12000 rpm離心(xīn)5min
   。（提(tí)前(qián)開(kāi)離心機預(yù)冷）

7. 7. 將(jiāng)離心(xīn)後的(dí)上(shàng)清(qīng)分裝到0.5min的(dí)離心管中(zhōng)放於(yú)-20℃保存(cún)
   。

8. 以上(shàng)步(bù)驟(zhòu)可簡單概述(shù)為
   ：收集細(xì)胞(bāo)，裂(liè)解細胞，離(lí)心(xīn)取上清，保存
   。

三(sān)，PBS推薦(jiàn)

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