1. PCR擴增(zēng)

PCR-SBT技(jì)術(shù)首(shǒu)先是對(duì)待測DNA進(jìn)行(háng)PCR擴增，以擴(kuò)增出分型區(qū)域(yù)。PCR，即(jí)聚合(hé)酶鏈反(fǎn)應(yīng)，是(shì)一種(zhǒng)在體外快(kuài)速(sù)擴(kuò)增特(tè)定DNA片段的(dí)方(fāng)法。在PCR過程中，需(xū)要(yào)設計特定的(dí)引物，它們(mén)能(néng)夠(gòu)與待(dài)擴增的(dí)DNA片段(duàn)兩端互補(bǔ)結(jié)合。然(rán)後，在(zài)DNA聚合(hé)酶(méi)的作用下(xià)，以dNTP為原(yuán)料，按照鹼(jiǎn)基(jī)互(hù)補(bǔ)配對(duì)的原則(zé)，合成(chéng)新的DNA鏈。通過(guò)多(duō)次(cì)循環的(dí)變性(xìng)，退火(huǒ)和延(yán)伸步驟，待測(cè)DNA片(piàn)段得(dé)以大量擴增(zēng)。

在PCR-SBT技術(shù)中，為(wéi)了擴(kuò)增出(chū)HLA基因(yīn)的(dí)多(duō)態(tài)性區(qū)域，通(tōng)常需要設(shè)計多個(gè)引(yǐn)物對(duì)。這(zhè)些(xiē)引物(wù)對(duì)能夠覆蓋HLA基(jī)因的所有可變(biàn)位(wèi)點(diǎn)，確(què)保擴增出所(suǒ)有可(kě)能的(dí)等(děng)位基(jī)因。通過(guò)PCR擴(kuò)增，可以得到大(dà)量(liáng)含有(yǒu)不同(tóng)等位基因序列的DNA片段。

SYBR GreenⅠ染(rǎn)料(liào)法(fǎ)原理(lǐ)示意(yì)圖

2. 序列(liè)反應

PCR擴(kuò)增(zēng)後的DNA片(piàn)段需(xū)要進(jìn)行(háng)測序(xù)，以(yǐ)確定(dìng)它們的具體(tǐ)序(xù)列(liè)。在PCR-SBT技術(shù)中，一般(bān)采用(yòng)Sanger測序(xù)技(jì)術，也(yě)被稱(chēng)為雙(shuāng)脫氧測序法(fǎ)。這(zhè)種測(cè)序(xù)方法基(jī)於DNA合(hé)成過(guò)程(chéng)中(zhōng)的鏈終(zhōng)止(zhǐ)反(fǎn)應。在(zài)測(cè)序反(fǎn)應中(zhōng)，向PCR擴增產(chǎn)物中加入四(sì)種熒(yíng)光標(biāo)記的雙脫氧核(hé)苷酸（ddNTP），它們(mén)與(yǔ)正(zhèng)常的(dí)dNTP在(zài)結構上(shàng)相(xiāng)似(sì)，但缺(quē)少一個羥(qiǎng)基，因此(cǐ)不能繼(jì)續(xù)參與(yǔ)DNA鏈的合成(chéng)。當(dāng)DNA聚(jù)合酶在合(hé)成(chéng)過(guò)程中(zhōng)遇到(dào)ddNTP時，鏈(liàn)的合成(chéng)就(jiù)會終(zhōng)止。由於(yú)ddNTP的(dí)熒光標記不同(tóng)，因(yīn)此可(kě)以(yǐ)通過熒光(guāng)檢(jiǎn)測(cè)器區(qū)分出不(bù)同的終(zhōng)止位(wèi)置，從而(ér)確定DNA序列。

3. 數據分析

測(cè)序(xù)得到的數據需要進行(háng)進(jìn)一步的(dí)分(fēn)析(xī)和(hé)比(bǐ)對。首(shǒu)先(xiān)，需(xū)要(yào)對(duì)測序數(shù)據(jù)進行整(zhěng)合(hé)和預(yù)處理，確定(dìng)每(měi)個可變位(wèi)點的基因型(xíng)組(zǔ)成，包括去(qù)除低質(zhì)量(liáng)的序(xù)列，拼(pīn)接重(zhòng)疊(dié)的(dí)序(xù)列(liè)片段(duàn)等。然(rán)後，將新測(cè)定的(dí)基因(yīn)型(xíng)與已知(zhī)的HLA等位(wèi)基(jī)因序列(liè)進(jìn)行比對，以確(què)定其種屬和(hé)亞(yà)種(zhǒng)。這一(yī)步驟(zhòu)需(xū)要(yào)借(jiè)助專業(yè)的(dí)數(shù)據(jù)庫和軟(ruǎn)件工(gōng)具，如(rú)IMGT/HLA數據(jù)庫等。通過(guò)比對分析，可以(yǐ)準確地(dì)確定(dìng)待測(cè)樣(yàng)本的基因型別(bié)。

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