封閉液(yè)的(dí)選(xuǎn)擇(zé)主(zhǔ)要基於抗體和(hé)目(mù)標蛋(dàn)白(bái)，日(rì)常內參，還(huán)有一(yī)些本(běn)底豐度比較(jiào)高(gāo)的(dí)蛋白用脫(tuō)脂牛(niú)奶封閉(bì)沒問題(tí)；磷酸化(huà)蛋白(bái)可(kě)采(cǎi)用(yòng)BSA，如(rú)若豐(fēng)度很低，或測上清(qīng)分泌(mì)蛋白個(gè)人比(bǐ)較(jiào)推(tuī)薦(jiàn)使用(yòng)成品(pǐn)快封，脫(tuō)脂(zhī)牛奶和BSA效(xiào)果其實(shí)都不(bù)太穩定(dìng)。

‌封閉(bì)液主(zhǔ)要有以下幾種：脫脂(zhī)奶(nǎi)粉(fěn)，牛(niú)血清(qīng)白(bái)蛋(dàn)白（BSA），血(xiě)清，明膠和聚(jù)乙烯吡(pǐ)咯(kǎ)烷酮(tóng)（PVP）。

一，5%脫(tuō)脂(zhī)牛(niú)奶

封(fēng)閉(bì)時間：室溫1-2h或(huò)者(zhě)4度(dù)過夜(yè)。

脫脂(zhī)奶(nǎi)粉zui常用和便(biàn)宜(yí)的封(fēng)閉(bì)劑，通(tōng)常(cháng)使(shǐ)用(yòng)濃(nóng)度(dù)為(wéi)2.5%-5%。其(qí)優(yōu)點(diǎn)是(shì)經(jīng)濟實(shí)惠且效果良好，但(dàn)缺(quē)點(diǎn)是如(rú)果目標蛋白被磷(lín)酸化，則不(bù)應使(shǐ)用脫脂(zhī)奶(nǎi)粉，因為牛(niú)奶中的酪蛋白(bái)會與抗磷酸化抗體結合，導(dǎo)致(zhì)非(fēi)特異性結合(hé)和高背(bèi)景(jǐng)信(xìn)號(hào)‌。

一般5%脫(tuō)脂牛奶(nǎi)pH大(dà)約(yuē)為6.0左右(yòu)，有些(xiē)研究稱脫脂奶(nǎi)粉需調PH到7.4左右，但是大多(duō)數抗體(tǐ)不調(tiáo)pH也(yě)可以(yǐ)做出(chū)來，封閉後可采(cǎi)用(yòng)1*TBST漂(piāo)洗(xǐ)10分鐘(zhōng)再(zài)孵育(yù)一抗。

⚠️注(zhù)意事(shì)項：

1，日常保存放4度(dù)，變質析(xī)出(chū)後(hòu)不(bù)要(yào)再繼續使用，配置新的5%脫脂(zhī)奶粉(fěn)。

2，配置(zhì)新的(dí)5%脫脂(zhī)奶粉時可用磁(cí)力攪拌使其充分溶解(jiě)，充(chōng)分溶(róng)解後(hòu)再(zài)使用。

二，BSA（牛血清(qīng)白蛋(dàn)白(bái)）

BSA是從牛(niú)血(xiě)清(qīng)中提(tí)純的(dí)白蛋白，通常(cháng)使(shǐ)用(yòng)濃度為(wéi)2%-5%。優點(diǎn)是(shì)純度(dù)較(jiào)高(gāo)，不容易產生非特異(yì)性(xìng)結合，適合(hé)對(duì)背景要(yào)求嚴格的(dí)實驗。缺點是BSA製劑可(kě)能含(hán)有磷酸化酪氨酸，會引起抗磷酸(suān)酪氨酸抗體(tǐ)的(dí)高(gāo)背景，且與凝(níng)集(jí)素探針不相(xiāng)容(róng)。

‌封閉(bì)時間(jiān)：室(shì)溫(wēn)1h，對(duì)於(yú)一些(xiē)背(bèi)景非常高的抗體，可以4℃過(guò)夜。

除(chú)了脫脂(zhī)奶(nǎi)粉之外(wài)，比較常用(yòng)的封閉劑，濃度(dù)可(kě)選2-5%。

磷(lín)酸化(huà)蛋白(bái)建(jiàn)議采(cǎi)用BSA或(huò)快封(fēng)，BSA效(xiào)果不穩(wěn)定，如果(guǒ)使用(yòng)BSA封閉(bì)一般，可(kě)以試試用快(kuài)速(sù)封(fēng)閉(bì)液(yè)。

三，全血清

通常使(shǐ)用(yòng)的(dí)濃(nóng)度(dù)為(wéi) 5-10%

使(shǐ)用(yòng)率較低，價格(gé)昂(áng)貴(guì)。

對比(bǐ)脫脂(zhī)奶粉和BSA也沒有什麼(mó)好處(chǔ)，一般(bān)不(bù)選擇。但血清(qīng)可以(yǐ)封(fēng)閉掉一(yī)抗及(jí)二抗和(hé)樣本(běn)Fc受體之間(jiān)的結合(hé)，BSA無(wú)法封(fēng)閉(bì)Fc受體(tǐ)。

四，成品快(kuài)速封(fēng)閉(bì)液

封(fēng)閉時(shí)間很快，基本(běn)隻需要10-15min即(jí)可，也有(yǒu)一(yī)些(xiē)是(shì)需要(yào)30min。

每個成品封閉液都有自己(jǐ)的(dí)Protocol，基(jī)本照做(zuò)就(jiù)沒(méi)問題。

成品(pǐn)快封通(tōng)常含(hán)有提(tí)純過的(dí)蛋(dàn)白(bái)，這種(zhǒng)封閉液(yè)比脫(tuō)脂(zhī)奶粉和(hé)BSA好(hǎo)的(dí)地(dì)方是(shì)裏(lǐ)麵不(bù)含有(yǒu)各(gè)種亂七(qī)八糟的增強背(bèi)景(jǐng)的蛋(dàn)白成分。

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