繼推出《》《》後，有沒(méi)有(yǒu)小(xiǎo)夥(huǒ)伴想(xiǎng)知道細(xì)菌內毒素如何去(qù)除呢？今(jīn)天讓(ràng)我們一(yī)起答(dá)疑(yí)解惑！

前(qián)言(yán)：19世(shì)紀，Ernstvon Bergmann提出(chū)了(liǎo)毒素的(dí)概念(niàn)，他(tā)認(rèn)為(wéi)腐爛的液(yè)體(tǐ)含有(yǒu)一種(zhǒng)水溶(róng)性但(dàn)不(bù)溶於酒精，耐熱，不(bù)揮(huī)發的物質(zhì)，這(zhè)種(zhǒng)物質(zhì)會(huì)引起(qǐ)疾病症狀。20世紀(jì)初(chū)，Pfeie等學者提(tí)出了(liǎo)內毒素的名稱(chēng)，確定了整(zhěng)個細菌家(jiā)族(zú)擁有基(jī)本相同的(dí)毒(dú)素(sù)，並發(fā)現了內毒素(sù)的熱原性(xìng)和(hé)毒(dú)性之(zhī)間(jiān)的(dí)密(mì)切(qiē)關係(xì)。20世(shì)紀中葉(yè)，Lüderitz 和Westphal等(děng)學者(zhě)從(cóng)患(huàn)者血(xiě)清中(zhōng)分離出(chū)內毒(dú)素，而(ér)將多糖和(hé)脂質等非(fēi)蛋白質的(dí)部(bù)分(fēn)命名(míng)為脂多糖(LPS)。此後對內毒素(sù)脂(zhī)多糖的(dí)化學(xué)表(biǎo)征(zhēng)發展(zhǎn)迅(xùn)速，相(xiāng)繼(jì)開展內(nèi)毒(dú)素脂(zhī)多糖的(dí)核(hé)心多糖，空(kōng)間結構，衍生(shēng)物，類(lèi)似物(wù)的化學合(hé)成(chéng)和生物分(fēn)析。細菌內(nèi)毒(dú)素(sù)結(jié)構分為(wéi)三(sān)個部(bù)分(fēn): 類脂(zhī)A(Lipid A)，核心多糖(Corepolysaccharide)和一(yī)係列重復的(dí)氧多(duō)糖(táng)側鏈(liàn)(O-polysaccharide side chain)。

 細(xì)菌內毒素如何去(qù)除？

細菌內(nèi)毒素，特(tè)別是(shì)脂多(duō)糖(táng)(LPS)，是革蘭氏陰性細(xì)菌(jūn)細胞(bāo)壁的(dí)一(yī)種(zhǒng)成分，對生物製(zhì)品，尤其是基於大腸杆菌(jūn)表達(dá)的病(bìng)毒(dú)樣(yàng)顆粒(lì)(VLP)疫苗的(dí)生產構成(chéng)了重(zhòng)大挑戰(zhàn)。內(nèi)毒素的(dí)復(fù)雜結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定(dìng)性(xìng)使其難以通過常(cháng)規(guī)純化技術去(qù)除(chú)，且其(qí)生(shēng)物活性強，即使是(shì)微(wēi)量(liáng)殘留(liú)也(yě)可(kě)能(néng)對疫(yì)苗的安全性和(hé)有效性(xìng)構成威(wēi)脅。同時(shí)，內毒素不(bù)是蛋白質，其(qí)熱(rè)穩定(dìng)性使得它即(jí)使在100℃的(dí)高溫(wēn)下(xià)加(jiā)熱(rè)1小時也不會(huì)被破壞。在更(gēng)高的(dí)溫度(如115℃)下濕熱處理(lǐ)30分鐘，也隻能破壞大約25%的熱(rè)原(yuán)質。為了(liǎo)ce di破(pò)壞內(nèi)毒(dú)素的生物活(huó)性，需(xū)要采用更高的(dí)溫(wēn)度(dù)和更長(cháng)的處(chǔ)理(lǐ)時間，如180℃下幹(gān)烤(kǎo)3-4小(xiǎo)時或(huò)250℃下幹烤1-2小(xiǎo)時。此外，強(qiáng)鹼(jiǎn)，強酸或(huò)強(qiáng)氧化(huà)劑(jì)加(jiā)溫煮(zhǔ)沸30分(fēn)鐘才能有效(xiào)破壞內(nèi)毒素。以(yǐ)下介紹(shào)幾種(zhǒng)比較(jiào)常(cháng)見(jiàn)的去(qù)除(chú)細(xì)菌內毒素的(dí)方(fāng)法(fǎ)。

1. 膜過濾(lǜ)法

膜(mó)過(guò)濾(lǜ)法是一(yī)種(zhǒng)物理去除內毒素的方法。由(yóu)於(yú)內毒素分子相(xiāng)對較大(dà)，通過選(xuǎn)擇合適(shì)的(dí)膜孔(kǒng)徑和操(cāo)作條件(jiàn)，可(kě)以實現(xiàn)內毒素(sù)的有(yǒu)效(xiào)截留。然(rán)而，這(zhè)種(zhǒng)方法需(xū)要特別注(zhù)意膜的選(xuǎn)擇(zé)和操(cāo)作參(cān)數(shù)的優化，以(yǐ)避(bì)免對目標(biāo)蛋(dàn)白(bái)或(huò)VLP造成(chéng)損失。

2. 親和(hé)層析法

親和層析法利用(yòng)特定的(dí)層析(xī)介(jiè)質(zhì)對內毒素的親和性進行去除(chú)。通過(guò)優化(huà)層析(xī)條(tiáo)件(jiàn)，如(rú)pH值和離(lí)子強度，可以(yǐ)進(jìn)一步(bù)提(tí)高(gāo)去除(chú)效率和(hé)降低(dī)蛋白(bái)損(sǔn)失。這種(zhǒng)方(fāng)法(fǎ)具有高(gāo)效，選擇性好的優點，但(dàn)需要針(zhēn)對具體的生(shēng)物(wù)製(zhì)品(pǐn)進行優化。特(tè)別是免疫吸附劑在(zài)生產中的運用使(shǐ)得(dé)生(shēng)物大(dà)分子的純化(huà)變(biàn)得簡(jiǎn)單(dān)。免(miǎn)疫(yì)吸附(fù)的原(yuán)理(lǐ)基於抗(kàng)原，抗(kàng)體(tǐ)的(dí)特異性作用，以(yǐ)目(mù)標(biāo)蛋白作(zuò)為抗原，將(jiāng)通過(guò)雜交瘤技術生產(chǎn)的單(dān)克(kè)隆(lóng)抗體偶聯於介(jiè)質(zhì)上，此介(jiè)質來吸(xī)附目(mù)標蛋白。由於相(xiāng)互作用(yòng)的高(gāo)度特異性，理論上(shàng)僅有目標(biāo)蛋白吸(xī)附(fù)於介質(zhì)上，內(nèi)毒(dú)素全(quán)部穿透，洗脫後將(jiāng)得(dé)到(dào)純度(dù)很(hěn)高的無(wú)熱原產(chǎn)品。

實際(jì)上，由(yóu)於介質(zhì)本身存在(zài)的非特(tè)異性(xìng)吸(xī)附，仍(réng)有(yǒu)少量的雜(zá)蛋(dàn)白和(hé)內(nèi)毒(dú)素同時(shí)被吸附，但(dàn)內(nèi)毒(dú)素含量是(shì)極(jí)低的(dí)。在幹擾(rǎo)素(IFN)生產(chǎn)中，洗脫(tuō)物(wù)內毒素含量(liáng)一(yī)般(bān)為0.25EU/mL。

3. 密度(dù)梯(tī)度超(chāo)離心法(fǎ)

密(mì)度梯度(dù)超離(lí)心(xīn)法(fǎ)依(yī)據內毒素(sù)與其(qí)他(tā)溶(róng)液組(zǔ)分在密(mì)度(dù)，沉降係數(shù)等方(fāng)麵的差異(yì)進行(háng)分離(lí)。然而，由(yóu)於內(nèi)毒素的存(cún)在形式(shì)多樣(yàng)，這(zhè)種方(fāng)法的應用受到一(yī)定(dìng)限(xiàn)製(zhì)，且操(cāo)作復(fù)雜(zá)，成(chéng)本(běn)較(jiào)高。

4. 活(huó)性炭吸(xī)附法

活(huó)性炭(tàn)吸附法(fǎ)適用(yòng)於小分子(zǐ)溶液或水中的內毒素去除。然(rán)而，它(tā)對有(yǒu)效成分也(yě)有吸(xī)附作用，且殘留(liú)的活性(xìng)炭不(bù)易去(qù)除，因此(cǐ)在(zài)實際應(yīng)用中(zhōng)需要謹(jǐn)慎考慮(lǜ)。

5. 分子篩(shāi)法(凝膠(jiāo)過濾(lǜ)層析)

分子篩(shāi)法利用(yòng)凝(níng)膠分(fēn)子篩的空間(jiān)網狀(zhuàng)結構(gòu)進(jìn)行過(guò)濾層析，適(shì)用(yòng)於蛋白(bái)分子量較小的(dí)溶(róng)液。這種(zhǒng)方法操(cāo)作簡便，但對內毒素的去除效(xiào)率(shuài)可能(néng)不如其他方(fāng)法(fǎ)高(gāo)。

內毒素可在(zài)水溶液(yè)中以(yǐ)非(fēi)極性(xìng)和離子(zǐ)相(xiāng)互作(zuò)用，形成(chéng)大小為1000kDa分子聚(jù)集體(tǐ)，它與多(duō)數(shù)生物(wù)蛋白分(fēn)子(zǐ)量差異較(jiào)大，基於這(zhè)一特征，可以(yǐ)采用凝膠過濾(lǜ)層析(xī)，將(jiāng)大(dà)分子(zǐ)內(nèi)毒(dú)素分(fēn)子與(yǔ)目標蛋白(bái)分離。但其處理量小(xiǎo), 處理時(shí)間較長。

6. 化(huà)學處理法

化(huà)學(xué)處理(lǐ)法通(tōng)過使(shǐ)用(yòng)特定(dìng)的(dí)化學(xué)物質，如Triton X-114進(jìn)行(háng)兩(liǎng)相分離，可以(yǐ)有效(xiào)去(qù)除LPS。然而，這(zhè)些化學(xué)物(wù)質(zhì)可能會(huì)對VLP的(dí)結構造成(chéng)損(sǔn)害，因(yīn)此需要在(zài)使(shǐ)用前進(jìn)行(háng)充分(fēn)的評(píng)估和(hé)優(yōu)化。

7. 離(lí)子交換(huàn)層(céng)析法(fǎ)

LPS帶(dài)有(yǒu)負(fù)電荷，因(yīn)此(cǐ)可以(yǐ)通過(guò)離子交換層析法進行(háng)去除(chú)。這種方法(fǎ)操作(zuò)簡便，且對目(mù)標蛋白的損(sǔn)失(shī)較小。然(rán)而，需要針(zhēn)對(duì)具體的(dí)生物(wù)製品(pǐn)選擇(zé)合(hé)適(shì)的(dí)離子交換(huàn)介質(zhì)和操作條件。

對於(yú)陰離子交換層(céng)析，內毒素(sù)在pH>2時(shí)帶負電(diàn)荷，與陰(yīn)離(lí)子(zǐ)交(jiāo)換介(jiè)質(zhì)Q或(huò)DEAE有較(jiào)強(qiáng)結(jié)合, 可(kě)使用(yòng)目(mù)標蛋(dàn)白(bái)從(cóng)陰(yīn)離子交(jiāo)換(huàn)填料(liào)流(liú)穿的方(fāng)式(shì)去除內(nèi)毒(dú)素(sù)；也(yě)可在目(mù)標蛋白和(hé)內(nèi)毒(dú)素(sù)同時結合(hé)於層析(xī)介(jiè)質上後(hòu)，由(yóu)於內毒(dú)素的結(jié)合能力(lì)較(jiào)蛋(dàn)白(bái)的結合能力強，因(yīn)此可(kě)先將(jiāng)目(mù)標蛋白洗(xǐ)脫出來，然後再用高鹽(yán)緩(huǎn)衝液或NaOH將內毒素洗(xǐ)出。

對於陽離子交(jiāo)換層(céng)析(xī)，在pH4.0時(shí)，內毒素還(huán)是帶有負電荷(hé)不能(néng)和填(tián)料結(jié)合(hé)而(ér)隨(suí)流(liú)動相流出(chū)層(céng)析柱，目(mù)標(biāo)蛋(dàn)白(bái)則(zé)可以(yǐ)與陽離(lí)子(zǐ)交(jiāo)換(huàn)介質結合(hé)，因(yīn)此采用陽離(lí)子交換(huàn)層析也(yě)可以很好(hǎo)的去除內毒(dú)素(sù)。此外，采(cǎi)用(yòng)一些(xiē)表麵活性劑(jì)比(bǐ)如Triton X-114，既能阻止(zhǐ)內(nèi)毒(dú)素結(jié)合(hé)在陰離子柱上也可阻(zǔ)止(zhǐ)內毒素結(jié)合(hé)在(zài)陽(yáng)離子(zǐ)柱上(shàng)。

8. 聚(jù)合物沉澱(diàn)法(fǎ)

這種(zhǒng)方法主要依(yī)賴於特(tè)定的聚(jù)合物，如聚(jù)乙二(èr)醇(chún)(PEG)，來(lái)沉澱出內(nèi)毒素(sù)(如LPS)。這(zhè)種方法(fǎ)操作(zuò)簡便，意味(wèi)著(zhuó)它不(bù)需要復雜的(dí)設備或高深的技(jì)術(shù)知識。然(rán)而，要實(shí)現最佳效果，必(bì)須嚴格(gé)控製(zhì)聚(jù)合物的濃度和(hé)操作(zuò)條件(jiàn)。這是(shì)因為(wéi)過(guò)高(gāo)的濃(nóng)度或不當的(dí)操作條(tiáo)件(jiàn)可能會對(duì)目標蛋白(bái)造成損失，從而影響最(zuì)終產(chǎn)品(pǐn)的質量和(hé)純度。

9. 遺傳工程改(gǎi)造法(fǎ)

近年(nián)來，通過(guò)遺傳工程改造大腸杆(gān)菌菌(jūn)株(zhū)，使(shǐ)其內(nèi)毒素生物合成途徑發生(shēng)變(biàn)化(huà)，從(cóng)而產生(shēng)脂(zhī)質(zhì)IVA而非完(wán)整的(dí)內毒分子(zǐ)，成為了一種新的去除內(nèi)毒(dú)素的(dí)方(fāng)法。脂(zhī)質(zhì)IVA是內(nèi)毒素(sù)的前(qián)體，不會(huì)觸(chù)發人(rén)類(lèi)典型(xíng)的(dí)內(nèi)毒(dú)素反(fǎn)應，因此是生產治療性蛋白的更安全選(xuǎn)項。這種(zhǒng)方法(fǎ)為(wéi)生物(wù)製品的生產(chǎn)帶來(lái)了重大進(jìn)步(bù)，因(yīn)為它(tā)可(kě)能(néng)消除了(liǎo)表達(dá)後(hòu)進行(háng)昂(áng)貴(guì)且(qiě)效率低下的內毒素去(qù)除(chú)過程的(dí)需求。

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