上期我們(mén)簡單介(jiè)紹了(liǎo)一下，這期我們詳(xiáng)細(xì)介紹一下具體使用步驟吧(bā)。

一，材料(liào)

1.組(zǔ)織處(chǔ)理(lǐ)工具:手術剪，手(shǒu)術刀(dāo)，鑷(niè)子(zǐ)等

2.儀(yí)器(qì):水(shuǐ)平(píng)離心機(jī)，組織(zhī)研(yán)磨儀，細胞計數(shù)儀。

3.試劑:RNase 抑製劑，BSA.

4.耗材(cái):含有(yǒu)鋯(gào)珠(zhū)的研管，低吸附(fù)槍(qiāng)頭，5mL和(hé)15mL離(lí)心管，40μm(和10μm)細胞篩.

二(èr)，動物(wù)細胞核(hé)懸液(yè)製(zhì)備試劑盒(hé)使(shǐ)用(yòng)方(fāng)法

準備工(gōng)作:

1，切取組(zǔ)織(zhī)約(yuē) 200mg(黃豆粒大(dà)小)

2，裂(liè)解(jiě)液，前(qián)懸液和(hé)後(hòu)懸液(yè)需要(yào)添(tiān)加 BSA，終濃度 1%，根據樣本(běn)所需(xū)試劑體積現用(yòng)現(xiàn)配(pèi)。細胞核(hé) RNA 相關實驗，實(shí)驗過(guò)程中(zhōng)所有(yǒu)試劑都需要加(jiā)RNase抑(yì)製(zhì)劑(jì)(終(zhōng)濃度1U/L)，根(gēn)據樣本所需(xū)試劑(jì)體(tǐ)積現用(yòng)現(xiàn)配(pèi)。如:每1mL溶液需要(yào)加(jiā)40 U/uL的RNase 抑(yì)製(zhì)劑25 μL.

三(sān)，動物(wù)細胞核(hé)懸(xuán)液(yè)製(zhì)備試劑盒操作(zuò)步驟(zhòu):

1.使用移液器吸取1mL 裂(liè)解(jiě)液，緩慢注入含有鋯珠(zhū)的研磨(mó)管中

2.迅速將細胞樣(yàng)本(běn)，新鮮組織(zhī)或冰凍(dòng)組織樣(yàng)本(běn)轉(zhuǎn)移(yí)至上(shàng)述(shù)裝有(yǒu)裂解(jiě)液(yè)和鋯珠的(dí)研磨(mó)管內勇(yǒng)盡(jìn)可能使組織(zhī)塊細(xì)小(xiǎo)均匀(yún)，如(rú)圖(tú)2

3.使用(yòng)組織(zhī)研磨(mó)儀研(yán)磨至(zhì)無(wú)明(míng)顯(xiǎn)組(zǔ)織大(dà)塊(kuài)，使(shǐ)組織(zhī)呈均匀的匀(yún)漿狀，如(rú)圖(tú)3.將研磨好(hǎo)的樣本靜置(zhì)2~3min(時間(jiān)不要(yào)超(chāo)過3min)，將樣本(běn)緩慢(màn)倒入40um 細(xì)胞(bāo)篩中(zhōng)進行(háng)過(guò)濾，使(shǐ)用(yòng)15m離(lí)心管收(shōu)集(jí)濾液5.使用(yòng)1~3mL前(qián)懸(xuán)液(yè)衝洗研磨(mó)管(guǎn)和(hé)細胞(bāo)篩，確(què)保殘留在其(qí)中的(dí)細胞和組織(zhī)碎片被(bèi)充(chōng)分(fēn)衝(chōng)洗下來，並將衝洗液一並(bìng)收(shōu)集到第4步裝有(yǒu)濾液(yè)的15m離(lí)心(xīn)管(guǎn)中。

6.使(shǐ)用水平離心機，4℃，500xg，離(lí)心5min，棄上清.

7.使用前(qián)懸(xuán)液(yè)重(zhòng)懸沉(chén)澱至300L，加(jiā)入(rù)等(děng)體(tǐ)積(300μ)的PB1，用移(yí)液器吹打混(hùn)匀(yún)。將混合後的600液(yè)轉(zhuǎn)移至一(yī)新(xīn)的5m離心管中。8.吸(xī)取 600LPB2,將(jiāng)槍(qiāng)頭緩慢(màn)插(chā)人(rén)離心管最(zuì)底層，輕柔緩慢加入(rù)PB2,使(shǐ)溶(róng)液自然分層(céng),避(bì)免(miǎn)擾動(dòng)下(xià)層溶(róng)液(yè)

9.吸取(qǔ)600μLPB3,將槍頭(tóu)緩(huǎn)慢插到(dào)離(lí)心管最(zuì)底(dǐ)層，輕柔緩慢(màn)加人PB3，使溶(róng)液再次(cì)分層操作過(guò)程中(zhōng)要保持手部穩(wěn)定，控(kòng)製(zhì)加(jiā)入(rù)液體(tǐ)的速度，如(rú)圖(tú)4.

10.務(wù)必(bì)使用(yòng)水(shuǐ)平(píng)離心機，並設(shè)置(zhì)為居中(zhōng)的加(jiā)速度和減速度(dù)，4°C，3000xg，離心20 min.11.離心(xīn)後(hòu)，緩慢(màn)取出離(lí)心管(guǎn)。溶液(yè)分成3層(céng)。核層(céng)位(wèi)於PB2和PB3溶(róng)液(yè)交界處，移除上方(fāng)碎(suì)片層(約(yuē)1000L)，去除碎(suì)片層(céng)後吸取核層(céng)(約400L液體(tǐ))於新的(dí)離心(xīn)管中，如圖(tú)4 和圖 5.

12.加人5倍體積(jī)(約2mL)的(dí)後懸(xuán)液，吹(chuī)打混(hùn)匀(yún)。

13.使用(yòng)水平離(lí)心(xīn)機，4℃，700xg離(lí)心(xīn)5min，棄上清

14.根(gēn)據(jù)所需的(dí)細(xì)胞(bāo)核濃(nóng)度，使用(yòng)約50~2mL的後(hòu)懸(xuán)液(yè)將沉(chén)澱重(zhòng)懸。若(ruò)需要(yào)較高的細(xì)胞核濃度(dù)，可選(xuǎn)擇(zé)較小(xiǎo)體積的(dí)後(hòu)懸液(yè);若需要較低(dī)濃度，則(zé)選擇(zé)較(jiào)大體積的(dí)後懸(xuán)液(yè)15.觀(guān)察(chá)計(jì)數儀明場，若存(cún)在(zài)大(dà)於(yú)細胞(bāo)核(hé)的碎片且細胞核量(liáng)足(zú)夠,可在保持細胞(bāo)核懸(xuán)液較(jiào)高(gāo)濃(nóng)度(dù)的情(qíng)況下，再經10μm 細胞(bāo)篩去(qù)除雜質(zhì)。若背(bèi)景(jǐng)幹淨，無明顯(xiǎn)雜質(zhì)，則可(kě)跳過此(cǐ)步驟16.質(zhì)控(kòng)結束(shù)後應立即進(jìn)行(háng)後(hòu)續(xù)相(xiāng)關(guān)實驗。