引言：

農杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是(shì)植物基因工(gōng)程(chéng)中(zhōng)重要的載體(tǐ)工具，其感(gǎn)受態細胞的(dí)製備質(zhì)量直(zhí)接(jiē)影(yǐng)響外源基因的轉化效率(shuài)。本(běn)文將詳細介(jiè)紹(shào)農杆(gān)菌感受態(tài)細(xì)胞的標準(zhǔn)化製(zhì)備(bèi)流程(chéng)，結合實驗優化技(jì)巧與注(zhù)意(yì)事項(xiàng)，助您(nín)提升轉化成(chéng)功率，滿足(zú)科研與產業(yè)化需(xū)求(qiú)。

一(yī)
，什麼是農杆(gān)菌(jūn)感(gǎn)受(shòu)態細胞？

感受態細胞指通過(guò)物理(lǐ)或化(huà)學(xué)處(chǔ)理(lǐ)使細菌處於(yú)易於吸(xī)收(shōu)外(wài)源(yuán)DNA的狀(zhuàng)態。農杆(gān)菌感(gǎn)受態(tài)細胞的(dí)製備是植物(wù)轉(zhuǎn)基(jī)因實驗的(dí)關鍵步(bù)驟(zhòu)，直接(jiē)影(yǐng)響Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率。目(mù)前主流(liú)方(fāng)法(fǎ)為CaCl₂化學(xué)法(fǎ)，具(jù)有(yǒu)成本(běn)低
，操(cāo)作(zuò)簡(jiǎn)便的優勢。

二
，實(shí)驗(yàn)材料(liào)準(zhǔn)備

菌(jūn)株(zhū)選擇：常用EHA105
，GV3101等致(zhì)病(bìng)性缺(quē)失型(xíng)農(nóng)杆(gān)菌(jūn)

培養(yǎng)基：YEB液(yè)體培養基(jī)（配(pèi)方：5g/L牛肉(ròu)膏，1g/L酵母提取物，5g/L蛋白(bái)腖，5g/L蔗糖(táng)，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，pH7.0）

試(shì)劑：無菌(jūn)0.1M CaCl₂溶液(yè)
，液氮
，50%甘油(yóu)

設備：超淨工作台
，離心機
，恒溫搖(yáo)床(chuáng)
，-80℃冰箱(xiāng)

三
，分步(bù)製(zhì)備(bèi)流程（含(hán)關(guān)鍵參(cān)數）

步驟(zhòu)1：菌種活化與(yǔ)擴增(zēng)

取(qǔ)-80℃保存的農杆菌(jūn)劃綫(xiàn)接(jiē)種於(yú)YEB固(gù)體培養基，28℃倒(dǎo)置培(péi)養(yǎng)48小(xiǎo)時

挑取(qǔ)單菌落接種至(zhì)5mL YEB液體培(péi)養基，28℃
，200rpm振蕩培(péi)養(yǎng)16-18小時

優化(huà)提示(shì)：OD₆₀₀達(dá)0.4-0.6時(shí)菌體(tǐ)處於對(duì)數(shù)生長(cháng)期(qī)，此(cǐ)時收獲(huò)細胞(bāo)活性最(zuì)佳

步(bù)驟2：菌(jūn)體(tǐ)收集與預(yù)冷(lěng)處(chǔ)理

將(jiāng)菌(jūn)液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷(lěng)的50mL離(lí)心管(guǎn)，冰浴10分鐘

4℃
，5000g離心10分(fēn)鐘(zhōng)，棄(qì)上(shàng)清(qīng)

加入(rù)10mL預(yù)冷(lěng)0.1M CaCl₂溶液，輕柔(róu)重(zhòng)懸菌(jūn)體

冰浴(yù)30分鐘，再(zài)次4℃離(lí)心10分(fēn)鐘

關(guān)鍵(jiàn)點(diǎn)：全程(chéng)保持(chí)低溫(wēn)（0-4℃），防止菌膜(mó)結(jié)構(gòu)受(shòu)損(sǔn)

步(bù)驟3：感受(shòu)態細胞製備

棄(qì)上(shàng)清(qīng)，加(jiā)入2mL預(yù)冷(lěng)0.1M CaCl₂溶液(yè)（含15%甘油）

輕柔吹(chuī)打(dǎ)重(zhòng)懸，分裝(zhuāng)至1.5mL離心(xīn)管（每(měi)管100μL）

液(yè)氮速凍(dòng)1分(fēn)鐘後轉入-80℃長期保存(cún)

配方優化(huà)：添加終(zhōng)濃度10mM MgCl₂可提(tí)升DNA結(jié)合效率(shuài)

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