一，細胞傳代

細胞(bāo)傳代(dài)培養是指將(jiāng)細胞(bāo)從一個(gè)培養瓶(píng)中移植(zhí)到(dào)下(xià)一(yī)個(gè)培養(yǎng)瓶中(zhōng)，繼續培(péi)養和增(zēng)殖的(dí)過程。傳代(dài)培養的目的是實現細胞擴(kuò)增，為(wéi)後續(xù)實(shí)驗(yàn)做(zuò)準(zhǔn)備(bèi)。一般細(xì)胞(bāo)可傳代(dài)10-50代。

指數(shù)生長期(qī)是細胞活力best的時期，可(kě)對細胞進(jìn)行各(gè)種實(shí)驗。細胞(bāo)生(shēng)長一(yī)段(duàn)時間後(hòu)會呈(chéng)現接觸抑(yì)製。而惡(è)性細(xì)胞(bāo)則(zé)無接觸抑(yì)製現象(xiàng)。癌細(xì)胞則由(yóu)於營養成分的(dí)消耗和細胞(bāo)代(dài)謝(xiè)產物(wù)的影響(xiǎng)而(ér)發生密度抑製(zhì)。細胞數量(liáng)達到飽(bǎo)和密(mì)度後，細胞與營養液的交換(huàn)麵積減少，代謝產物(wù)積累(léi)，pH值(zhí)下降(jiàng)細(xì)胞(bāo)停止增殖(zhí)，進(jìn)入停滯(zhì)期(qī)。在(zài)此時應(yīng)及時(shí)進行傳(chuán)代，否則(zé)因細胞(bāo)中(zhōng)毒受損，大量(liáng)細胞出現死亡，至(zhì)少(shǎo)再傳(chuán)1-2代後，細胞才能恢復。

二，貼壁細(xì)胞(bāo)傳代(dài)操作步驟(zhòu)

1）將(jiāng)培(péi)養(yǎng)基(jī)，胰酶及PBS等預先在37℃水(shuǐ)浴中加熱30分鐘
；

2）從(cóng)培(péi)養(yǎng)箱中取(qǔ)出(chū)細胞(bāo)，當細胞融合率達(dá)到(dào)85%以上時即可進行傳代(dài)
；

3）將培(péi)養瓶(píng)內(nèi)的舊(jiù)培養液(yè)吸除或(huò)傾倒(dǎo)，使用PBS清(qīng)洗瓶內殘(cán)留(liú)培(péi)養(yǎng)基(jī)，並(bìng)倒(dǎo)盡
；

4）向(xiàng)瓶(píng)內加(jiā)入(rù)適(shì)量(liáng)的(dí)0.25%胰(yí)蛋白酶溶液，確保(bǎo)其能覆蓋(gài)培養(yǎng)瓶底部，T25瓶約需(xū)1ml，T75瓶約(yuē)需1-2ml
；

5）將(jiāng)培(péi)養瓶置於(yú)37℃孵箱(xiāng)或室溫(wēn)（25℃）下進(jìn)行消(xiāo)化，觀(guān)察(chá)細胞(bāo)狀態(tài)，待細胞wanquan變(biàn)圓且輕輕(qīng)敲(qiāo)打瓶(píng)身(shēn)時有(yǒu)部分(fēn)細胞脫落為準。一般情(qíng)況下，細(xì)胞消(xiāo)化(huà)過程持續(xù)1-2分鐘(zhōng)即可(kě)完(wán)成(chéng)
；

6）直接(jiē)添加(jiā)適(shì)量含血(xiě)清的(dí)培養(yǎng)基以(yǐ)終(zhōng)止消(xiāo)化(huà)，T25瓶可(kě)加入2ml或(huò)以上(shàng)，T75瓶可加入3ml或以(yǐ)上
；

7）使用吸管吸(xī)取瓶內培養液，按順(shùn)序輕(qīng)柔地吹(chuī)打(dǎ)瓶壁，使細胞從(cóng)瓶壁(bì)上脫落(là)
；

8）對(duì)細(xì)胞進行計數，取25μl細胞(bāo)懸液，65μl PBS與(yǔ)10μl台盼(pàn)藍(lán)混合均匀後，取10μl置於(yú)計(jì)數(shù)板中，使(shǐ)用顯微鏡進(jìn)行計數，以判斷(duàn)細胞(bāo)濃度
；

9）根(gēn)據細胞濃度(dù)進行(háng)細胞分瓶培(péi)養(yǎng)。一(yī)般(bān)按(àn)照1
：2至1
：8的(dí)比例(lì)進行傳代，將細(xì)胞(bāo)接種(zhǒng)於新(xīn)的培養瓶(píng)中(zhōng)，置於CO2培養(yǎng)箱中培(péi)養(yǎng)。具體(tǐ)傳代比例需依據(jù)細胞量而定，傳(chuán)代過(guò)稀(xī)會導致(zhì)細(xì)胞(bāo)生長(cháng)緩(huǎn)慢，傳(chuán)代過密(mì)則可(kě)能引起接(jiē)觸抑製(zhì)或(huò)密度抑(yì)製等問題，影(yǐng)響(xiǎng)細胞生長
；

10）細胞貼壁後，更(gēng)換培(péi)養液(yè)的時間(jiān)應(yīng)根據細胞(bāo)生長狀態(tài)和實(shí)驗需(xū)求而(ér)定，一(yī)般建(jiàn)議在2至(zhì)3天後更換培(péi)養(yǎng)液(yè)。

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