一，MLPA核心(xīn)原(yuán)理一(yī)句話概(gài)括(kuò)

MLPA通(tōng)過設(shè)計(jì)一對(duì)特(tè)殊的，靶(bǎ)向相(xiāng)鄰DNA序列的(dí)探針，隻有(yǒu)當這(zhè)對探針(zhēn)同時(shí)與靶序(xù)列wanmei結(jié)合時(shí)，才能連(lián)接成一個完整(zhěng)的(dí)模板(bǎn)，隨(suí)後被(bèi)通(tōng)用引物擴增(zēng)並(bìng)定量(liáng)。擴增(zēng)產物(wù)的量直(zhí)接反(fǎn)映了靶(bǎ)序列的(dí)拷貝數。

二(èr)， MLPA檢測原理(lǐ)分步詳解(jiě)

下麵，我們(mén)來詳(xiáng)細解讀(dú)流程(chéng)中(zhōng)的每一個關鍵步(bù)驟：

 第1步：探(tàn)針雜交(jiāo)

   一(yī)對(duì)探針(zhēn)：針對每(měi)一(yī)個待(dài)檢(jiǎn)測的靶(bǎ)位點(diǎn)，都(dū)設(shè)計有兩條(tiáo)非(fēi)常短的寡(guǎ)核苷(gān)酸探針。

       左(zuǒ)探針：包含一段(duàn)靶序(xù)列特(tè)異(yì)性雜交序列 + 一段通(tōng)用的“引(yǐn)物(wù)結合(hé)"序列(liè)X。

       右(yòu)探(tàn)針：包(bāo)含(hán)一(yī)段靶(bǎ)序列特(tè)異(yì)性(xìng)雜交序列 + 一段長(cháng)度不等(děng)的(dí)“填充(chōng)序列" + 一段通(tōng)用的“引(yǐn)物結(jié)合"序(xù)列Y。

   特(tè)異(yì)性結合(hé)：將(jiāng)這一(yī)對探(tàn)針與變性後的樣本(běn)DNA混(hùn)合。它們(mén)會尋找並(bìng)精(jīng)確地雜(zá)交(jiāo)到(dào)目標DNA上相鄰(lín)的位(wèi)置（通(tōng)常隻間(jiān)隔1個核苷(gān)酸）。

 第2步(bù)：連接(jiē)反應（最(zuì)關鍵的(dí)一步）

   “連(lián)接(jiē)依賴"的(dí)核心：隻(zhī)有當(dāng)左(zuǒ)，右探(tàn)針(zhēn)都wanmei地(dì)與靶DNA結(jié)合並(bìng)緊密(mì)相鄰時(shí)，連接(jiē)酶才(cái)能(néng)將(jiāng)它(tā)們共價(jià)連接成(chéng)一條(tiáo)完整的，長的DNA模板。

   嚴苛的(dí)質(zhì)控(kòng)：如果(guǒ)靶(bǎ)序(xù)列缺失（拷(kǎo)貝數為0）或(huò)發(fā)生點突變(biàn)導致(zhì)探針無法結合(hé)，連接反(fǎn)應就不會(huì)發(fā)生(shēng)。這(zhè)確保了(liǎo)後(hòu)續信號的(dí)特(tè)異(yì)性(xìng)，避免了(liǎo)假(jiǎ)陽(yáng)性。

 第(dì)3步：PCR擴(kuò)增(zēng)

   通用引(yǐn)物(wù)擴(kuò)增：使用(yòng)一對針(zhēn)對所(suǒ)有連(lián)接產(chǎn)物上(shàng)通(tōng)用序(xù)列(liè)X和Y的引物(wù)進(jìn)行(háng)PCR擴(kuò)增(zēng)。

   產物長度(dù)各異：由於(yú)每(měi)個右(yòu)探針的“填充序列"長度(dù)不同(tóng)，因此(cǐ)每個(gè)靶(bǎ)位點(diǎn)對(duì)應的最(zuì)終PCR產物都(dū)具(jù)有(yǒu)獨(dú)特(tè)的長度（就(jiù)像(xiàng)不同大小的“條形碼"）。

 第4步：毛(máo)細(xì)管(guǎn)電(diàn)泳分(fēn)離與定(dìng)量

   按長度(dù)分離(lí)：將所有PCR產物進行毛細(xì)管電泳(yǒng)，嚴格按照(zhào)片段長度進(jìn)行(háng)分離(lí)。

   熒光檢測：PCR引物或(huò)探針上標記有(yǒu)熒(yíng)光(guāng)基團，因此(cǐ)每(měi)個長(cháng)度的片段會產(chǎn)生一(yī)個熒光信號峰。

 第5步(bù)：數據分析

   峰(fēng)高/麵積 = 相對(duì)拷貝數：通過軟(ruǎn)件分析每(měi)個峰(fēng)的(dí)高度(dù)或麵積(jī)。將其與同一(yī)反應(yīng)中(zhōng)多個(gè)內參(cān)基(jī)因(yīn)（已知為二倍體，拷(kǎo)貝數(shù)穩定(dìng)）的峰(fēng)進行(háng)比較。

   結果解讀(dú)：

       正常(cháng)拷(kǎo)貝(bèi)數(shù)（2份）：靶位點(diǎn)峰高與內參峰(fēng)高比(bǐ)值約為(wéi)1.0。

       缺失（1份或(huò)0份）：比值(zhí)約為(wéi)0.5或(huò)0。

       重復/擴增（3份或以上）：比值(zhí)約(yuē)為1.5或(huò)更高(gāo)。

三， MLPA原(yuán)理的獨(dú)特優勢(shì)

1.  高通(tōng)量：單次反(fǎn)應(yīng)可(kě)輕(qīng)鬆(sōng)檢測40-50個(gè)不同(tóng)的靶(bǎ)位(wèi)點。

2.  高(gāo)特異性與準(zhǔn)確(què)性：依賴“雙探針wanmei結合(hé)"的連接(jiē)步(bù)驟(zhòu)，如同雙重(zhòng)校驗，極(jí)大(dà)減(jiǎn)少(shǎo)了非特異性擴增。

3.  對(duì)DNA質量要(yào)求(qiú)低(dī)：因(yīn)為探針很短(duǎn)（~50-70 nt），即(jí)使(shǐ)DNA部分(fēn)降(jiàng)解(jiě)（如(rú)FFPE樣本），也(yě)能有(yǒu)效(xiào)雜交和(hé)連接(jiē)，而(ér)長(cháng)片(piàn)段PCR則會失(shī)敗(bài)。

4.  可(kě)檢測甲基化（MS-MLPA）：通過對右探(tàn)針的(dí)雜交序列進行HhaI酶(méi)切位點(diǎn)設(shè)計。如果(guǒ)靶(bǎ)序(xù)列被甲基化，酶(méi)切被阻(zǔ)止(zhǐ)，探針(zhēn)可連接擴增(zēng)；如(rú)果(guǒ)未(wèi)甲基化(huà)，酶切斷開(kāi)探針，無法擴增。通(tōng)過比較(jiào)酶切處理與未處(chǔ)理的(dí)信號，即可判斷甲基化(huà)狀態(tài)。

四，與(yǔ)其他(tā)技術的(dí)核心區別(bié)

總(zǒng)結(jié)來(lái)說(shuō)，MLPA的原理(lǐ)精髓(suǐ)在於其“連(lián)接依賴(lài)"和(hé)“長(cháng)度(dù)編(biān)碼"的(dí)設計，使(shǐ)其(qí)成為檢(jiǎn)測已(yǐ)知基(jī)因拷(kǎo)貝(bèi)數變(biàn)異和甲(jiǎ)基化(huà)的一種高(gāo)度多重，精準(zhǔn)且經(jīng)濟高(gāo)效(xiào)的(dí)技(jì)術，特(tè)別適用於臨(lín)床診斷和大規(guī)模篩(shāi)查(chá)。

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