核(hé)心特點：是陽離(lí)子脂質(zhì)體(tǐ)試劑(jì)，其配(pèi)方(fāng)中包含專屬的(dí) P3000™ 增強(qiáng)劑，能顯著提高轉(zhuǎn)染(rǎn)效(xiào)率(shuài)，尤(yóu)其對難(nán)轉染細胞(bāo)和(hé)DNA轉染效果(guǒ)出色。其(qí)操(cāo)作是將脂質體(tǐ)與DNA分別(bié)稀(xī)釋(shì)後再混(hùn)合，簡(jiǎn)化(huà)了(liǎo)流程(chéng)。

一，標(biāo)準轉染步驟（以24孔板為例(lì)）

以(yǐ)下步驟可按(àn)比例(lì)放大或縮小。

 材(cái)料準備

- Lipofectamine 3000 試(shì)劑

- P3000™ 增強劑(jì)（隨(suí)試(shì)劑(jì)盒提供(gōng)）

- 待(dài)轉染的質粒DNA

- Opti-MEM® 或(huò)其(qí)它(tā)無血清(qīng)培養基（必須(xū)使用，不能用wan全培養基(jī)或(huò)PBS）

- 狀(zhuàng)態良好(hǎo)，密(mì)度(dù)約(yuē)70-90%的細胞(bāo)（具(jù)體(tǐ)zui-佳密度需(xū)根(gēn)據細胞類(lèi)型(xíng)優化(huà)）

- 無(wú)抗(kàng)生(shēng)素的wan全培養(yǎng)基（轉染前(qián)後更換）

 實(shí)驗(yàn)前(qián)一日(rì)：細(xì)胞鋪(pū)板

將細胞接種於24孔板中，使(shǐ)轉染時細胞密(mì)度達(dá)到(dào) 70-90% 匯合(hé)度(dù)。使用(yòng)正常的wan全培養基。

 轉染當(dāng)日（以每(měi)孔計算(suàn)）

A. 溶液配(pèi)製(zhì)（使(shǐ)用(yòng)前輕(qīng)輕混(hùn)匀各(gè)試(shì)劑，切勿渦(wō)旋）

1.  稀釋(shì)質粒(lì)DNA溶(róng)液(yè)：

       取一(yī)支無菌(jūn)離心(xīn)管(guǎn)，加入(rù) 50 µL Opti-MEM 培養基。

       加入(rù) 0.5 - 1.0 µg 質粒DNA（zui-佳(jiā)用量需優化(huà)）。

       加(jiā)入(rù) 1 µL P3000™ 增(zēng)強劑。輕輕吹(chuī)打或(huò)輕彈管(guǎn)壁混(hùn)匀，室溫(wēn)孵(fū)育5分鐘(zhōng)（可(kě)選，但推薦）。

2.  稀釋Lipofectamine 3000試(shì)劑(jì)：

       取(qǔ)另(lìng)一支(zhī)無菌(jūn)離心(xīn)管，加入 50 µL Opti-MEM 培養(yǎng)基(jī)。

       加入 1.5 µL Lipofectamine 3000 試(shì)劑(jì)。立即(jí)輕輕吹打(dǎ)或輕彈(dàn)混匀（脂質體容(róng)易(yì)沉降）。室溫靜置(zhì) 5分鐘(zhōng)。

B. 形(xíng)成脂(zhī)質(zhì)體(tǐ)-DNA復(fù)合(hé)物

   將 稀釋好(hǎo)的DNA溶液(yè)（步(bù)驟(zhòu)A1） 全部(bù)加入(rù) 含(hán)有稀釋脂質體的管子（步驟(zhòu)A2） 中(zhōng)。

   輕(qīng)輕(qīng)吹打混匀 或 輕(qīng)彈管(guǎn)壁混(hùn)匀。切(qiē)勿(wù)渦(wō)旋。

   室溫靜(jìng)置 10-15分鐘，讓復(fù)合(hé)物(wù)穩(wěn)定(dìng)形(xíng)成(chéng)。溶液(yè)可能會輕微渾濁，這是(shì)正(zhèng)常現象(xiàng)。

C. 將(jiāng)復合(hé)物加入細胞

   將(jiāng) 100 µL 的脂質(zhì)體(tǐ)-DNA復(fù)合物(wù)溶液(yè)，逐(zhú)滴(dī)均(jūn)匀地加入(rù)到含(hán)細胞(bāo)的孔中。

   輕(qīng)輕(qīng)前後(hòu)左右(yòu)搖晃(huǎng)培(péi)養(yǎng)板(bǎn)，使復合物(wù)分布(bù)均匀。

   將(jiāng)細(xì)胞放(fàng)回37°C，5% CO₂培養(yǎng)箱中(zhōng)繼續(xù)培(péi)養。

D. 換液(yè)與檢(jiǎn)測(cè)（時(shí)間(jiān)點需優化(huà)）

   轉染(rǎn)後4-6小時(shí)，觀(guān)察(chá)細(xì)胞狀(zhuàng)態(tài)。如(rú)果脂質體毒(dú)性較大，此時(shí)應(yīng)更換(huàn)為(wéi)新鮮(xiān)的wan全培養基(jī)（可(kě)含(hán)抗生素(sù)）。

   如果細胞狀(zhuàng)態(tài)良(liáng)好，也可(kě)不換(huàn)液繼續(xù)培(péi)養(yǎng)。

   在(zài)轉(zhuǎn)染後 24-72小(xiǎo)時(shí)（取決於(yú)實(shí)驗(yàn)目的和報告(gào)基(jī)因(yīn)）進(jìn)行蛋(dàn)白(bái)或(huò)mRNA水平的(dí)檢測。

二(èr)，關鍵(jiàn)注(zhù)意事項(xiàng)與(yǔ)優(yōu)化(huà)建議(yì)

1.  細(xì)胞狀(zhuàng)態至關(guān)重(zhòng)要：使(shǐ)用低傳代，生長旺(wàng)盛的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時細胞(bāo)必(bì)須處於(yú)對數生(shēng)長(cháng)期(qī)。

2.  無血清與(yǔ)無(wú)抗(kàng)生(shēng)素：配製復合物(wù)必須使用(yòng) Opti-MEM。轉染前(qián)後培養(yǎng)基(jī)應(yīng)不含抗(kàng)生素(sù)，以(yǐ)減少(shǎo)細胞毒性(xìng)和幹(gān)擾。

3.  試(shì)劑輕柔(róu)混匀：Lipofectamine 3000 和(hé)形成的(dí)復(fù)合物都(dū)不(bù)能渦旋(xuán)，劇烈操作(zuò)會破(pò)壞脂(zhī)質(zhì)體(tǐ)結構(gòu)。

4.  DNA純度(dù)要求高：使(shǐ)用(yòng)內(nèi)毒素低(dī)，純(chún)度高的質(zhì)粒（OD260/280 ≈ 1.8-2.0）。

5.  比(bǐ)例優(yōu)化(huà)：shou ci實驗(yàn)必須進(jìn)行劑量(liáng)優(yōu)化。優(yōu)化兩個(gè)變(biàn)量：

       DNA用(yòng)量：通常在(zài)0.25 µg - 1.5 µg/孔（24孔板）之間測試。

       Lipofectamine 3000 用(yòng)量：與DNA的比(bǐ)例（µL : µg）通常在 1:1 到(dào) 3:1 之間測試（例(lì)如，0.5 µg DNA 搭配(pèi) 0.5 µL， 1.0 µL， 1.5 µL試劑(jì)）。

6.  P3000™增強(qiáng)劑(jì)：其(qí)用量(liáng)與DNA量成正比（通常為(wéi) 2 µL/µg DNA），但也可(kě)以微調。

7.  陰性(xìng)對照：務必設置隻加(jiā)脂(zhī)質體復合(hé)物(wù)（不含(hán)DNA）的對(duì)照組(zǔ)，以評(píng)估(gū)脂質體(tǐ)本身(shēn)的(dí)細胞毒性。

8.  復合物(wù)孵育(yù)時(shí)間：10-15分(fēn)鐘(zhōng)足夠，過(guò)長(cháng)（如>30分(fēn)鐘(zhōng)）可能降低效率。

三(sān)，簡明步(bù)驟總(zǒng)結

1.  鋪(pū)板(bǎn)：細(xì)胞達70-90%匯(huì)合(hé)。

2.  配(pèi)液(yè)A：Opti-MEM + DNA + P3000，混匀。

3.  配液B：Opti-MEM + Lipo3000，混匀(yún)，靜置5分(fēn)鐘(zhōng)。

4.  混合(hé)：將A加入B，混匀(yún)，室溫靜置10-15分(fēn)鐘。

5.  加樣：將復(fù)合物逐滴加入(rù)細(xì)胞，輕柔混(hùn)匀。

6.  培(péi)養：4-6小時後換(huàn)液(yè)（視情況(kuàng)），繼續培養24-72小時檢(jiǎn)測。

lipo3000現(xiàn)貨(huò)

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