IPSC培養標(biāo)準(zhǔn)操作(zuò)流(liú)程

更(gēng)新(xīn)時間(jiān)：2026-02-09

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iPSC來(lái)源廣(guǎng)泛，具有(yǒu)較(jiào)強的體(tǐ)外擴增(zēng)，復製和(hé)分(fēn)化能(néng)力，較低(dī)的(dí)免(miǎn)疫原性(xìng)，較(jiào)高的基(jī)因編輯效率等。基於這(zhè)些(xiē)優(yōu)勢，iPSC技術已廣(guǎng)泛(fàn)應用(yòng)於(yú)疾病建(jiàn)模(mó)，藥物發現和開(kāi)發(fā)，是個(gè)性化細(xì)胞治療(liáo)和再(zài)生醫學研(yán)究的(dí)重(zhòng)要科學(xué)工(gōng)具。

那麼它具(jù)體怎(zěn)麼培養(yǎng)呢？

一，IPSC培養(yǎng)之實(shí)驗前準(zhǔn)備

試劑：預熱的無滋養層(céng)培(péi)養(yǎng)基（如mTeSR™ Plus， E8），基質膠包(bāo)被的培養(yǎng)板，解(jiě)離試劑(jì)（如(rú) Gentle Cell Dissociation Reagent，不含(hán)酶(méi)），PBS，ROCK抑(yì)製(zhì)劑(jì)（Y-27632）。

設備：37°C， 5% CO₂培養箱，倒置顯微鏡(jìng)，超淨(jìng)工(gōng)作台(tái)。

二，IPSC培(péi)養之基質膠(jiāo)包(bāo)被(bèi)培(péi)養(yǎng)板

用預冷(lěng)的PBS或無(wú)血清DMEM按(àn)說明書比例稀(xī)釋基(jī)質膠。

迅速將(jiāng)稀(xī)釋液加入培(péi)養板中（6孔板(bǎn)約(yuē)1 mL/孔(kǒng)），室溫(wēn)靜置至(zhì)少1小(xiǎo)時或(huò)4℃過(guò)夜。

使用(yòng)前吸棄包(bāo)被液，無(wú)需晾幹，直(zhí)接(jiē)接種細(xì)胞。

三(sān)，IPSC培(péi)養之日常觀察與換(huàn)液

每日觀(guān)察(chá)：在顯微鏡(jìng)下觀(guān)察細胞(bāo)狀態(tài)。健(jiàn)康的iPSC克隆(lóng)應邊界清晰，細胞(bāo)核大，核質比(bǐ)高(gāo)，克(kè)隆(lóng)內細(xì)胞排列(liè)緊密。邊(biān)緣出(chū)現(xiàn)扁(biǎn)平(píng)，拉長或透明的(dí)細(xì)胞是(shì)分化的(dí)征兆(zhào)。

換(huàn)液：每天換液一(yī)次。輕柔吸(xī)棄(qì)舊培(péi)養(yǎng)基，沿孔壁(bì)緩慢加入預(yù)溫(wēn)的新鮮培養基，避免吹打(dǎ)克隆。

四，IPSC培(péi)養(yǎng)之(zhī)傳代（關(guān)鍵步(bù)驟(zhòu)）

iPSC通(tōng)常(cháng)每(měi)4-7天(tiān)傳(chuán)代(dài)一次(cì)，當克隆(lóng)大(dà)到開(kāi)始互(hù)相接觸時(shí)進(jìn)行(háng)。

方案(àn)A：酶解法（EDTA或Accutase）：

1. 吸(xī)棄(qì)培(péi)養基，用(yòng)PBS輕(qīng)柔(róu)清洗(xǐ)一次(cì)。

2. 加(jiā)入適量含(hán)0.5 mM EDTA的PBS或(huò)Accutase，37℃孵育3-5分(fēn)鐘。

3. 在顯(xiǎn)微鏡(jìng)下觀(guān)察(chá)，當克隆(lóng)邊緣開始(shǐ)卷起，細胞(bāo)間隙變大(dà)時(shí)，迅速吸(xī)棄解(jiě)離(lí)液(yè)。

4. 加入(rù)含10 μM ROCK抑製劑(jì)的完全培養(yǎng)基(jī)，用1mL移液器輕柔(róu)吹打(dǎ)成小團塊(kuài)（約幾(jī)十到幾(jī)百個(gè)細(xì)胞(bāo)一(yī)團(tuán)）。切(qiē)忌(jì)吹(chuī)成(chéng)單細胞(bāo)！

5. 離(lí)心，重懸(xuán)，按適當比(bǐ)例（通常1:6至1:20）接種到新(xīn)包(bāo)被(bèi)的板(bǎn)上。

方案B：手動挑克隆(lóng)法(fǎ)：

用於(yú)去除(chú)分化(huà)部分，單克隆篩選或(huò)處(chǔ)理(lǐ)珍(zhēn)貴(guì)細(xì)胞係(xì)。

在顯微鏡下(xià)用拉細的(dí)巴(bā)斯德管或專(zhuān)用挑(tiāo)針，物理刮取未分化(huà)的(dí)克(kè)隆(lóng)區域，轉(zhuǎn)移(yí)至(zhì)新孔。

關鍵點：傳(chuán)代後24小時內，在(zài)培(péi)養基中加入ROCK抑(yì)製(zhì)劑(jì)，可顯著(zhù)提(tí)高克隆(lóng)形成(chéng)率和存活率。

五(wǔ)，IPSC培養之凍存(cún)與(yǔ)復蘇

凍(dòng)存(cún)：使(shǐ)用適合無血(xiě)清培(péi)養的專(zhuān)用(yòng)凍存液（如CryoStor® CS10），或(huò)含10% DMSO + 30%血(xiě)清(qīng)替代(dài)物 + 60%基(jī)礎培養(yǎng)基的(dí)自(zì)配(pèi)凍存液(yè)。以(yǐ)小團塊(kuài)形式凍存(cún)。

復蘇：

1. 快速解(jiě)凍細胞(bāo)。

2. 用(yòng)含(hán)大量ROCK抑(yì)製(zhì)劑(jì)的培養基重懸並(bìng)接種。

3. 24小(xiǎo)時後全(quán)量換液為正常培(péi)養基(jī)。

六(liù)，常(cháng)見問題與對策

問題	可能原(yuán)因(yīn)	解決(jué)方(fāng)案
自發分化率(shuài)高(gāo)	傳代(dài)過度消化（單(dān)細胞過(guò)多(duō)），接種密度過(guò)低(dī)，細胞過(guò)密，培養基過期(qī)或(huò)pH不(bù)穩(wěn)定(dìng)。	優(yōu)化消化(huà)時間；提(tí)高(gāo)接(jiē)種密度(dù)；及時(shí)傳代；使用(yòng)新(xīn)鮮培(péi)養(yǎng)基，檢查培養箱CO₂濃度。
克隆不生長/死亡	傳代(dài)損傷(shāng)（單(dān)細(xì)胞化(huà)嚴重），復蘇(sū)損(sǔn)傷(shāng)，ROCK抑製(zhì)劑未加(jiā)或失效，基質(zhì)膠包被失效。	傳(chuán)代時保持(chí)細胞團(tuán)塊；確保(bǎo)使用(yòng)ROCK抑(yì)製劑；驗(yàn)證(zhèng)基質膠(jiāo)活(huó)性(xìng)和(hé)包被(bèi)流(liú)程。
細(xì)胞形(xíng)態不佳（扁平，鬆(sōng)散）	開始分(fēn)化，培養體係不適用，汙染(rǎn)（如(rú)支(zhī)原體(tǐ)）。	鏡下標(biāo)記(jì)並刮除分(fēn)化區域(yù)；檢查培養(yǎng)基和基質(zhì)膠匹(pǐ)配性(xìng)；進行支原體檢(jiǎn)測(cè)。
克隆(lóng)難以(yǐ)吹下(xià)	基質膠批(pī)號差異，消化時間不足，細胞過度生長。	適(shì)當延(yán)長消(xiāo)化(huà)時(shí)間(jiān)或在37℃孵育(yù)；嘗試不(bù)同(tóng)批號(hào)基(jī)質膠。

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