在(zài)生(shēng)物醫學(xué)實驗室中(zhōng)，HEK293 細胞培(péi)養 是(shì)一項基礎(chǔ)且(qiě)至關(guān)重要的技能。作為一種易於轉(zhuǎn)染且(qiě)蛋(dàn)白(bái)表達(dá)能力強的(dí)人胚腎(shèn)上皮細(xì)胞(bāo)係(xì)，HEK293 細胞(bāo)被(bèi)廣泛(fàn)應用(yòng)於(yú)病毒(dú)包裝(zhuāng)
，重(zhòng)組(zǔ)蛋(dàn)白生產以(yǐ)及(jí)信號轉導(dǎo)研究。然(rán)而，要(yào)獲(huò)得(dé)高活力
，狀態(tài)穩(wěn)定的細胞，必須嚴(yán)格遵(zūn)守(shǒu)標(biāo)準(zhǔn)操作規程（SOP）。本(běn)文將(jiāng)詳細介紹 HEK293 細(xì)胞(bāo)培(péi)養(yǎng) 的全流程，包括培(péi)養(yǎng)基配(pèi)置(zhì)
，細(xì)胞復蘇(sū)
，傳(chuán)代(dài)
，凍存(cún)及常見問題(tí)排查，助力科研人員建立穩健的細胞(bāo)培(péi)養體係。

一
， 培養基與試劑的準(zhǔn)備

1. 基礎(chǔ)培(péi)養(yǎng)基： 推薦使(shǐ)用(yòng)高糖型 DMEM 培養(yǎng)基。高糖(táng)環(huán)境能夠(gòu)滿(mǎn)足(zú) HEK293 細(xì)胞快速增殖的(dí)能量(liáng)需(xū)求(qiú)。

2. 血清(qīng)補充： 需(xū)添(tiān)加胎牛血清（FBS），濃度通常為 10%。優(yōu)質的(dí)胎牛(niú)血(xiě)清能提供(gōng)細(xì)胞生長所需(xū)的生長因(yīn)子
   ，激素和貼壁(bì)因(yīn)子(zǐ)。建議選擇(zé)經(jīng)過嚴(yán)格(gé)質(zhì)檢
   ，內毒(dú)素(sù)低的(dí)熱滅活或非(fēi)熱滅(miè)活(huó)血(xiě)清（視實驗(yàn)具體(tǐ)需求而(ér)定(dìng)）。

3. 雙抗添加： 為預防細菌汙染，通常在培養(yǎng)基(jī)中添加 1% 的(dí)青(qīng)黴素(sù) - 鏈黴素溶液（Penicillin-Streptomycin）。

4. 消(xiāo)化液(yè)： 常(cháng)用的(dí)為 0.25% 胰蛋白酶(méi) - EDTA 消(xiāo)化(huà)液。由於 HEK293 細胞對胰酶(méi)較為(wéi)敏(mǐn)感(gǎn)，消化時間不(bù)宜過長。

二
， 細胞復蘇(sū)

1. 快(kuài)速解凍(dòng)： 從(cóng)液氮罐中取出凍(dòng)存(cún)管後，應迅速(sù)投入(rù) 37℃ 水浴中(zhōng)。輕(qīng)輕晃(huǎng)動(dòng)凍(dòng)存管，確保(bǎo)在(zài) 1-2 分(fēn)鐘內(nèi)wan全解凍(dòng)（注意：不要將凍存管(guǎn)口浸入水中(zhōng)，以防汙(wū)染）。

2. 離(lí)心洗(xǐ)滌： 將(jiāng)解(jiě)凍(dòng)後的細胞(bāo)懸(xuán)液(yè)吸入含有 5ml wan全(quán)培(péi)養(yǎng)基的離(lí)心管中，在(zài) 1000 rpm 轉速下(xià)離(lí)心 5 分(fēn)鐘，目的(dí)是去除凍存液中(zhōng)的 DMSO（二(èr)甲基亞碸），因為(wéi) DMSO 在(zài)常(cháng)溫(wēn)下(xià)對細胞有(yǒu)毒(dú)性(xìng)。

3. 重懸接種： 棄去(qù)上清液，加(jiā)入(rù)新鮮(xiān)wan全培養(yǎng)基重沉細胞沉澱(diàn)。將(jiāng)細胞(bāo)懸(xuán)液接種至(zhì)培養瓶(píng)或(huò)培(péi)養(yǎng)皿中(zhōng)，置(zhì)於(yú) 37℃
   ，5% CO2 的(dí)培養箱中靜(jìng)置(zhì)培養。

4. 觀(guān)察(chá)換(huàn)液： 次日顯微(wēi)鏡(jìng)下觀(guān)察細胞貼(tiē)壁(bì)情(qíng)況(kuàng)，若(ruò)細胞(bāo)密度(dù)較高(gāo)且死(sǐ)細胞(bāo)較少(shǎo)，可更(gēng)換(huàn)新(xīn)鮮培養基(jī)以去除(chú)殘留的死細胞(bāo)。

三(sān)
， 細(xì)胞傳(chuán)代(dài)

1. 棄去舊(jiù)液： 吸除舊的培(péi)養(yǎng)基，用(yòng) PBS 緩衝(chōng)液(yè)輕輕清(qīng)洗細胞(bāo)表(biǎo)麵一次，以(yǐ)去(qù)除殘(cán)留的血清（血清會(huì)抑製(zhì)胰(yí)酶活(huó)性(xìng)）。

2. 胰酶消(xiāo)化： 加入(rù)適量(liáng) 0.25% 胰(yí)酶（覆蓋瓶底即(jí)可(kě)），置於(yú) 37℃ 培(péi)養箱(xiāng)中消化 1-2 分鐘(zhōng)，或(huò)在(zài)顯(xiǎn)微鏡(jìng)下觀察細胞(bāo)回縮變圓。

3. 終止消化： 加入含(hán)血(xiě)清(qīng)的wan全培養基，胰(yí)酶與血清接(jiē)觸後立即失去活性(xìng)。輕輕(qīng)吹(chuī)打瓶壁，使細(xì)胞wan全(quán)脫落(là)並分散成(chéng)單(dān)細胞懸液。

4. 分裝培養： 按(àn)照(zhào) 1:3 至(zhì) 1:6 的比例(lì)將細胞(bāo)懸液(yè)分裝(zhuāng)至新(xīn)的培養瓶(píng)中(zhōng)，補足培養基後繼(jì)續(xù)培養。

四
， 細(xì)胞凍存

1. 收集(jí)細(xì)胞(bāo)： 取(qǔ)對數生(shēng)長期的細(xì)胞(bāo)，按照上(shàng)述(shù)傳(chuán)代步驟消化(huà)並離(lí)心收(shōu)集。

2. 配製凍(dòng)存(cún)液(yè)： 推薦(jiàn)使(shǐ)用 90% wan全(quán)培(péi)養基 + 10% DMSO，或者使用專(zhuān)用(yòng)的細胞(bāo)凍存液(yè)。

3. 重懸分裝： 用凍存(cún)液(yè)重懸細胞，調(tiáo)整密度(dù)至 1×10^6 cells/ml 左右。將(jiāng)細胞懸液(yè)分裝(zhuāng)入凍存管(guǎn)。

4. 梯(tī)度(dù)降溫(wēn)： 使用(yòng)程序降(jiàng)溫盒（如 Mr. Frosty）置(zhì)於 -80℃ 冰(bīng)箱(xiāng)過(guò)夜(yè)，使細(xì)胞(bāo)以(yǐ) -1℃/ 分(fēn)鐘(zhōng)的(dí)速(sù)度(dù)緩慢降(jiàng)溫，次日(rì)將(jiāng)凍(dòng)存管(guǎn)轉移(yí)至(zhì)液氮罐(guàn)中(zhōng)長期保(bǎo)存(cún)。

五
， 常見(jiàn)問題與注(zhù)意(yì)事項

• 生長(cháng)緩慢： 可能是血清質(zhì)量(liáng)下降
  ，培養基 pH 值(zhí)不(bù)適宜或(huò)細(xì)胞(bāo)代(dài)數過(guò)高。建議更換優質血清(qīng)或復(fù)蘇低代數(shù)細(xì)胞種。

• 狀態不佳（發(fā)亮
  ，漂浮）： 可能是消(xiāo)化過度或培養(yǎng)箱 CO2 濃度波動。應嚴(yán)格控製消化時間(jiān)，並定(dìng)期校(xiào)準(zhǔn)培養(yǎng)箱(xiāng)環境。

• 汙染(rǎn)： 無菌(jūn)操作(zuò)是(shì) HEK293 細胞培養 的生命綫。所(suǒ)有操作應(yīng)在(zài)超(chāo)淨工作(zuò)台中進行(háng)，定期(qī)檢查支原體(tǐ)汙(wū)染(rǎn)。

  
  

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