材料(liào)與(yǔ)儀器(qì)

1. 緩衝(chōng)液，溶(róng)液(yè)和試劑
氯仿
焦碳(tàn)酸二乙酯(zhǐ)（DEPC) 處理過的(dí) H20(GenHimterR105)
乙(yǐ)醇(chún)
70% 乙醇(chún)洗(xǐ)液(yè)（用 DEPC 處(chǔ)理過(guò)的 H20 配(pèi)製(zhì)）
異(yì)丙醇
苯酚(fēn)-胍鹽(yán)單相溶液(yè)（推(tuī)薦 RNApure,GenHunterP501-P503)
磷酸(suān)鹽緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)（PBS)
2. 離心機和(hé)轉(zhuǎn)頭(tóu)
小(xiǎo)離心機(jī)
3. 專(zhuān)用設備(bèi)
50 ml 錐(zhuī)形管
1.5 ml 小離心管(guǎn)
1000ul(原文(wén)為(wéi) ml。—譯者改）移(yí)液(yè)器(qì)
100~150 mm 平(píng)板(bǎn)
P10 移(yí)液器(qì)
Pdytron 匀漿(jiāng)器（用(yòng)於(yú)從組織(zhī)中提取(qǔ) RNA)

步(bù)驟(zhòu)

一，RNA 提(tí)取
方法(fǎ) 1: 從組織培養物中提取(qǔ) RNA
1. 如果(guǒ)細胞(bāo)貼在瓶壁(bì)或平(píng)板上，則倒掉培養(yǎng)基，將平(píng)板(bǎn)置(zhì)於冰上(shàng)。
2. 如(rú)果細胞(bāo)是(shì)懸浮的，旋(xuán)轉離下細胞，並(bìng)除(chú)去培養(yǎng)基(jī)。
3. 用 10~20 ml 的(dí)冷(lěng)磷(lín)酸鹽緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)（PBS) 漂洗(xǐ)細(xì)胞。
4. 倒掉 PBS，並用 1000ul 移(yí)液(yè)器吸去(qù)殘(cán)留的 PBS。
5. 每 100~150 mm 平(píng)板(bǎn)加(jiā)入(rù) 2 ml 苯酚-胍鹽單相溶(róng)液(yè)（RNApure)，以裂解細胞(bāo)（搖晃平(píng)板(bǎn)使(shǐ)溶(róng)液(yè)分布均(jūn)匀）。這個(gè)體積足夠(gòu)裂解(jiě) 100 萬~1000 萬(wàn)個細胞(bāo)。
6. 將(jiāng)平(píng)板放在冰上(shàng) 10 min。
7. 將裂解液吸(xī)到(dào)兩(liǎng)個(gè)標記好的 1.5 ml 離(lí)心管(guǎn)中。
方法 2: 從組(zǔ)織中提取(qǔ) RNA
1. 在(zài)裝有組(zǔ)織(zhī)的 50 ml 錐(zhuī)形管中(zhōng)，加(jiā)入(rù)至(zhì)少 2 ml 苯(běn)酚-胍鹽(yán)單相溶(róng)液（RNApure), 並置於冰上。組(zǔ)織和酚溶(róng)液的理(lǐ)想比(bǐ)例至少應(yīng)該是 1:10。
2. 用(yòng) Polytron 匀(yún)漿器(qì)將(jiāng)組(zǔ)織(zhī)攪匀(yún)，直(zhí)到組(zǔ)織(zhī)wan全(quán)分(fēn)散(sàn)為(wéi)止。
3. 將(jiāng)管(guǎn)子置於(yú)冰上(shàng)10min。
4. 取 1ml 裂解液，分裝(zhuāng)到(dào)標記(jì)好(hǎo)的 1.5 ml 離(lí)心管中。
方(fāng)法(fǎ) 3: 從血(xiě)液(yè)中提(tí)取(qǔ) RNA
1. 將血液(yè)產品(pǐn)離心，並(bìng)除(chú)去血(xiě)漿(jiāng)。
2. 按照(zhào)上麵(miàn)從(cóng)組織中(zhōng)提取(qǔ) RNA 的說明逬行操作。

二(èr)，RNA 的(dí)純化
1. 每毫升裂解液(yè)加入 150ul 氯(lǜ)仿(fǎng)，渦旋混匀(yún) 10min。
本(běn)方(fāng)案可以在(zài)此處停止，並將(jiāng)裂解液放置(zhì)在-80°C
2. 在 4°C 以(yǐ)最(zuì)大轉(zhuǎn)速離心 10min。
3. 小(xiǎo)心地(dì)將上清液轉(zhuǎn)移到一個幹淨的，標(biāo)記好的 1.5 ml 離心管中。
4. 加(jiā)入(rù)等(děng)體積的異(yì)丙醇(chún)，並在冰上放置(zhì) 10min，然(rán)後劇(jù)烈地(dì)混(hùn)匀(yún)或渦(wō)旋混(hùn)匀 30s。
5. 將混合物(wù)在(zài) 4°C 以最(zuì)大轉速離心(xīn) 10min。
6. 用(yòng) 1ml 預冷的(dí) 70% 乙醇（用 DEPC 處理(lǐ)過(guò)的 H20 配製）洗滌 RNA 沉澱(diàn)，在(zài) 4°C最(zuì)大轉速離心 2 min。
7. 倒(dǎo)掉(diào)乙(yǐ)醇(chún)。短暫離(lí)心後(hòu)，用移(yí)液器吸去(qù)殘留的洗液。
8. 將 RNA 在 5ulDEPC 處(chǔ)理過的 H20 中重(zhòng)新懸浮。
注意：如果(guǒ) RNA 用(yòng)於(yú)任何擴(kuò)增反(fǎn)應(yīng)，懸(xuán)浮(fú)液(yè)中(zhōng)不(bù)要(yào)使用 SDS。
9. 取(qǔ)1ul RNA(用(yòng) P10 移(yí)液器）測定(dìng)濃度，用1ml H20 稀(xī)釋。在 260nm 下讀(dú)數，注(zhù)意 1OD260=40ug。

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