材(cái)料與(yǔ)儀(yí)器

Triton X-100 匀漿(jiāng)緩衝液(yè) 酚(fēn) 氯仿(fǎng) 乙酸鈉 乙(yǐ)醇(chún) 氯(lǜ)化鋰(lǐ)

步(bù)驟(zhòu)

一 材料與(yǔ)設備(bèi)
1)5%TritonX-100
2) 匀漿緩(huǎn)衝液：50 mmol/LNaCl,50 mmol/LTris-Cl,(PH7.5),5 mmol/LEDTA(pH8.0),0.5%SDS,200ug/ml 蛋甶(fú)酶 K
3) 酚：氯仿(fǎng) (1:1)
4)3mol/L 乙(yǐ)酸鈉(nà) (pH5.2)
。
5) 乙醇
6)8mol/L 氯化(huà)鋰(lǐ)
二(èr) 操作方法
1) 將待(dài)處(chǔ)理的組織(zhī)放(fàng)置下(xià)一(yī)個幹烤過(guò)的(dí)玻璃匀(yún)漿器內(nèi)，棄(qì)去(qù)無(wú)關的(dí)液體，用 0.5% TriwnX-100 洗滌(dí)蠅(yíng)胚(pēi)，以去除(chú)培(péi)養(yǎng)基(jī)
。
2) 加 10 倍(bèi)體積的匀(yún)漿緩衝液(yè)
，立即研磨(mó)使(shǐ)組織che底匀漿化
。
3) 於 37℃ 將組織匀(yún)漿(jiāng)溫育 l h, 間(jiān)或(huò)混匀(yún)之
。
4）將(jiāng)匀(yún)漿(jiāng)移至(zhì)離心管(guǎn)內(nèi)，加(jiā)等(děng)體積(jī)酚(fēn)：氯仿（1:1)，劇烈振(zhèn)蕩 1 min，用(yòng)吊(diào)桶(tǒng)式轉頭(tóu)於室溫以 5000 g 離(lí)心(xīn) l0mim, 使水(shuǐ)相和有(yǒu)機(jī)相分開
。
5) 將上層水相移至(zhì)另一離心(xīn)管(guǎn)內. 按(àn)步(bù)驟 4 用酚：氯仿(fǎng)（1:1) 再抽提(tí) 1 次
。
6) 將(jiāng)水(shuǐ)相移至為(wéi)-管(guǎn)內(nèi)，加 0.1 體積 3mol/L 乙酸(suān)鈉 (PH5.2)，混(hùn)匀(yún)，加 2.5 倍(bèi)體積冰預(yù)冷(lěng)的(dí)乙(yǐ)醇(chún)，冰(bīng)浴 2 h
7) 於 4°C 以(yǐ) 5000 g 離心 l5 min，小(xiǎo)心去(qù)除上(shàng)淸液，室(shì)溫晾下(xià) RNA 沉(chén)澱. 少量水溶解(jiě)RNA, 加 3 倍體積乙(yǐ)酔，於—70℃ 儲存備(bèi)用.如(rú)要除(chú)去(qù)糖(táng)蛋白和(hé)卵黃物質，則可根據需(xū)要(yào)逬(bèng)行(háng)步驟(zhòu) 8)〜11)
8) 用(yòng)少量水(shuǐ)重溶(róng) RNA 沉澱，加等(děng)體積(jī)經髙(gāo)壓滅菌的(dí) 8mol/L 氯化鋰(lǐ)，混(hùn)匀，一(yī) 20℃放(fàng)置 3 h 以(yǐ)上
。
9) 於 4℃ 以 10000 g 離心(xīn) 30 min 沉澱 RNA, 小(xiǎo)心(xīn)棄上清(qīng)
。
10) 用 70% 乙(yǐ)醇洗滌沉(chén)澱(diàn)，離心片(piàn)刻(kè)，棄去(qù)上清液. 於空氣中(zhōng)晾(liàng)幹核酸沉澱(diàn)
。
11) 用少量水重溶 RNA, 加 3 倍(bèi)體積乙醇(chún)，於 一 70℃ 儲(chǔ)存備用
。

注意事(shì)項

1) 用氯(lǜ)化(huà)鋰(lǐ)沉(chén)澱(diàn) RNA 從而有助於去除糖蛋白和卵(luǎn)黃物(wù)質
2) 由於此方(fāng)法分離(lí)的 RNA 量大(dà)超過(guò)汙染的 DNA 量，因(yīn)此不必除(chú)去(qù)製品(pǐn)中的 DNA
。盡(jìn)管汙(wū)染(rǎn)的基因組 DNA 序(xù)列(liè)不(bù)幹擾(rǎo)雜交(jiāo)和(hé)翻譯，但如(rú)果此 RNA 用於(yú)構建 cDNA 文庫，則(zé)這些 DNA 可能會(huì)引起混(hùn)亂，在(zài)這種(zhǒng)情況(kuàng)下吋用(yòng)無 RNA 酶(méi)的(dí)胰(yí) DNaseI 進行(háng)消(xiāo)化(huà)，以(yǐ)去除汙染的 DNA

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