材料與(yǔ)儀器(qì)

作為(wéi)對照(zhào)的(dí)核(hé)提取物(wù)或(huò)蛋白組分(fēn) 核提取(qǔ)物或(huò)蛋(dàn)白組分
Ficoll 400 聚乙烯(xī)醇 蔗(zhè)糖染色(sè)液 10X Tris-氨(ān)基(jī)乙酸或Tris-硼(péng)酸-EDTA(TBE)緩衝(chōng)液 4%~7% 中性(xìng)聚丙(bǐng)烯(xī)酰(xiān)胺凝(níng)膠(jiāo) poly(dI-dC) 32P標記(jì)的對照DNA 32P標記(jì)的靶(bǎ)DNA
雜交(jiāo)膜

步驟(zhòu)

材(cái)料(liào)
緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)和(hé)溶液
貯存(cún)液，緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)和(hé)試(shì)劑的組成請參見(jiàn)附錄1。
貯(zhù)存液(yè)需(xū)稀(xī)釋(shì)到適當(dāng)濃(nóng)度。
Ficoll 400(20%m/V)
Ficoll溶解在無菌水(shuǐ)中(zhōng)，分(fēn)裝(zhuāng)成100ul並凍存在-20°C。
聚乙(yǐ)烯醇（10%m/V)
聚乙烯醇溶解在無(wú)菌(jūn)水(shuǐ)中, 分裝成(chéng)100ul並(bìng)凍存(cún)在-20°C。
蔗(zhè)糖(táng)染(rǎn)色液
0.25%(m/V)溴酚(fēn)蘭
0.25%(m/V)二甲(jiǎ)苯青
40%(m/V)蔗耱(mò)（葡萄糖）
溶解(jiě)於水，用(yòng)0.22um濾(lǜ)器過(guò)濾(lǜ)
；貯存(cún)於室溫(wēn)或(huò)4°C。
10X Tris-氨(ān)基乙酸(suān)或Tris-硼酸-EDTA(TBE)緩衝液(yè)
凝膠
4%~7% 中(zhōng)性聚(jù)丙烯(xī)酰胺(àn)凝(níng)膠(jiāo)（厚度≤1.5 mm)
核酸和寡核(hé)苷酸
poly(dI-dC)(lmg/ml)
適(shì)量(liáng)poly(dI-dC)溶於無(wú)菌水中(zhōng)，每(měi)管分裝(zhuāng)100ul並(bìng)凍存(cún)在-20°C。關(guān)於(yú)poly(dI-dC)在凝(níng)膠阻滯試驗中的作用的(dí)更(gēng)多信息(xī)請見(jiàn)信患欄poly(dI-dC)部分。

放射性化(huà)合(hé)物
32P標記的對照(zhào)DNA
32P標(biāo)記的(dí)靶DNA>20bp[比活(huó)性≥2.5x107cpm/噸（≥5000cpm/fmol)]
DNA 片段標記(jì)可以(yǐ)通過(guò)磷(lín)酸化（第 9 章(zhāng)方案 13~16, 或第 10 章(zhāng)方案(àn) 2); 用 DNA 聚合酶(méi)補(bǔ)平 3'-退縮末端(duān)（第 9 章(zhāng)方案 10, 或(huò)第 10 章(zhāng)方(fāng)案 7); 或(huò)用(yòng) PCK 方法使帶(dài)放射標記的(dí)核苷酸(suān)播(bō)到探(tàn)針(zhēn)中(zhōng)（第 8 章(zhāng)方(fāng)案(àn) 1)。最(zuì)後(hòu)一(yī)種方(fāng)法(fǎ)最快，提供的探(tàn)針比活(huó)性也(yě)最高有(yǒu)關怎(zěn)樣(yàng)標(biāo)記(jì) DNA 探(tàn)針的(dí)建(jiàn)議，請見本方案末尾的(dí)欄目：疑難解析(xī)及凝膠阻滯(zhì)分(fēn)析(xī)試驗的(dí)優(yōu)化。
特(tè)殊設(shè)備(bèi)
雜(zá)交膜(mó)
細(xì)胞(bāo)和組織
作為對(duì)照的(dí)核提(tí)取物(wù)或蛋白組(zǔ)分
核提取物(wù)或蛋白組(zǔ)分(fēn)
用方案 1 中介紹的任意(yì)一(yī)種(zhǒng)方(fāng)法(fǎ)製備提(tí)取(qǔ)物。在兔(tù)網織(zhī)紅細胞裂(liè)解(jiě)物(wù)或(huò)麥(mài)胚(pēi)提(tí)取(qǔ)物(wù)中進行體外(wài)翻譯(yì)得(dé)到的(dí)蛋白也(yě)可以(yǐ)用(yòng)來作(zuò)為 DNA 結(jié)合蛋(dàn)白(bái)。如果是(shì)後一(yī)種(zhǒng)情況，通(tōng)常(cháng)用(yòng) 1~20ul 蛋白(bái)來(lái)替代核(hé)提取(qǔ)物。
方法
1. 在無(wú)菌(jūn)的(dí) 1.5 ml 離心(xīn)管(guǎn)中(zhōng)加入(rù):
32P 標記(jì)的靶 DNA 1ng(1~10fmol)
1 mg/ml poly(dI-dC) 1ul
核(hé)提取(qǔ)物（5~10ug） ≤10ul
或(huò)者
蛋白組分(fēn) ≤10ul
20%Ficoll 400 5ul
或者
10% 聚乙烯醇 4ul
H2O 加到 20ul
2. 反(fǎn)應(yīng)管離(lí)心(xīn)幾(jī)秒鐘使反應混合(hé)物沉到管(guǎn)底。冰(bīng)浴(yù) 10~30 min。

3. 每(měi)管加(jiā)入(rù) 3ul 蔗糖染(rǎn)色液(yè)。樣品加(jiā)到 4%~7% 中(zhōng)性聚(jù)丙稀酰(xiān)胺(àn)凝膠中。

4. 在 0.5XTris-甘(gān)氨(ān)酸(suān)緩衝液或(huò) 0.5XTBE 緩(huǎn)衝液中(zhōng)跑(pǎo)膠，200~250V,20mA,≥2 h。
根(gēn)據結(jié)合蛋(dàn)白(bái)的不(bù)穩定(dìng)性(xìng)和結合反應(yīng)的親和(hé)性，有時(shí)候(hòu)可能需要在 4°C 跑膠。

5. 電泳完(wán)成後，撬開凝(níng)膠(jiāo)板，把凝(níng)膠轉到(dào)一(yī)片(piàn)結實的雜交(jiāo)膜上，在(zài)幹膠(jiāo)機上幹膠約(yuē) 1 h。

6. 用幹(gān)膠對(duì) X 射綫膠(jiāo)片在-20°C 曝光≥1h, 使(shǐ)放(fàng)射標記的(dí) DNA 片(piàn)段(duàn)顯現(xiàn)出(chū)來。豐(fēng)度低(dī)一(yī)些的(dí) DNA-蛋(dàn)白復合物(wù)用(yòng)磷屏(píng)圖(tú)像分析大約(yuē) 1~3 h 就可以(yǐ)檢測(cè)到。