在(zài)細(xì)胞生(shēng)物(wù)學
，藥物(wù)開發(fā)
，腫瘤(liú)研(yán)究等(děng)領域，快(kuài)速
，準確(què)地(dì)評估細(xì)胞(bāo)增殖與毒(dú)性是至關重要的實驗環(huán)節。其中，CCK-8試劑(jì)盒因其操(cāo)作簡(jiǎn)便
，靈敏度高(gāo)
，安全性好等優勢(shì)，已(yǐ)成為國內(nèi)外實(shí)驗室的(dí)標(biāo)配檢(jiǎn)測方法。
 

　　一
，CCK-8實(shí)驗原(yuán)理：高(gāo)效的酶促反應顯色(sè)
 

　　CCK-8.全(quán)稱為(wéi)Cell Counting Kit-8.其核心(xīn)原理是(shì)一種基(jī)於(yú)顯色反(fǎn)應(yīng)的生物(wù)化(huà)學(xué)檢測方(fāng)法(fǎ)。
 

　　在(zài)活細(xì)胞內部(bù)，始終存(cún)在一種(zhǒng)名(míng)為(wéi)綫粒(lì)體脫氫(qīng)酶(méi)的代(dài)謝(xiè)酶(méi)。該酶具有持續(xù)的(dí)活性。CCK-8試劑中(zhōng)含有(yǒu)一種名(míng)為WST-8 的(dí)獨特水溶(róng)性四(sì)唑(zuò)鹽化(huà)合物。
 

　　當活細胞(bāo)與(yǔ)CCK-8試劑共同孵(fū)育(yù)時，會發生以下連鎖(suǒ)反應(yīng)：
 

　　WST-8分子(zǐ)進入細(xì)胞(bāo)。
 

　　在活細胞綫粒體(tǐ)內(nèi)的脫氫酶(méi)催化下，WST-8被還(huán)原(yuán)，生(shēng)成(chéng)高度水(shuǐ)溶性的橙(chéng)色(sè)甲瓚(zàn)產(chǎn)物(wù)。
 

　　該(gāi)甲(jiǎ)瓚染(rǎn)料會(huì)溶(róng)解(jiě)在(zài)細(xì)胞培養液(yè)中(zhōng)，且其(qí)生成量與活細(xì)胞的(dí)數量成正比。
 

　　因(yīn)此，通(tōng)過(guò)使用酶(méi)標(biāo)儀(yí)在450nm波(bō)長(cháng)下(xià)測量培(péi)養液的吸(xī)光(guāng)度值，即可直接
，準確地(dì)反推出(chū)樣品中(zhōng)活(huó)細(xì)胞的相對數(shù)量。細胞(bāo)增殖越(yuè)快或毒性越小，吸(xī)光度值就越(yuè)高。
 

 

　　二(èr)
，CCK-8實(shí)驗詳(xiáng)細步(bù)驟(以(yǐ)96孔板為例)

 

　　實驗(yàn)前(qián)準備：
 

　　儀器(qì)： 酶標儀
，CO₂培(péi)養箱(xiāng)
，超淨工(gōng)作台
，移液器。
 

　　材料(liào)： 96孔細胞培養板
，CCK-8試劑。
 

　　細胞： 處於(yú)對數生長(cháng)期的(dí)健康細胞(bāo)。
 

　　DAY 1
 

　　1. 對(duì)前一天培養好的細(xì)胞消(xiāo)化
，離心
，計數(shù)。
 

　　2. 在96孔板(bǎn)上接種(zhǒng)100μL 3k-7k/孔(kǒng)的(dí)細胞(bāo)，在(zài)37℃
，5% CO2
，90%濕度(dù)條(tiáo)件(jiàn)下(xià)培(péi)養24小時(shí)。
 

　　DAY 2
 

　　1. 在顯微鏡(jìng)下觀察細胞(bāo)生長(cháng)狀態和密度，取生(shēng)長(cháng)狀態(tài)良好，細(xì)胞分(fēn)布及(jí)密度(dù)均(jūn)一的孔(kǒng)進行實(shí)驗(yàn)。
 

　　2. 配(pèi)製不同濃(nóng)度(dù)梯(tī)度(dù)的樣本溶(róng)液，如(rú)300
，100
，33.3
，11.1
，3.7
，1.2
，0.4
，0.14uM。每個濃度三個(gè)復(fù)孔加入(rù)到96孔(kǒng)板(bǎn)中(zhōng)，在37℃
，5% CO2
，90%濕度條件下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(jiān)長度。如(rú)6.12.24或48小時。
 

　　DAY 3/4
 

　　1. CCK8使用(yòng)前在室溫下解凍並離心(xīn)。
 

　　2. 用倒置顯微鏡檢(jiǎn)測細胞(bāo)生(shēng)長(cháng)狀態，並(bìng)用(yòng)4X/10X取(qǔ)生(shēng)長狀(zhuàng)態良(liáng)好，細(xì)胞分布及密度均一(yī)的(dí)孔(kǒng)拍照記(jì)錄(lù)。
 

　　3. 在每(měi)孔中(zhōng)加(jiā)入10μL的(dí)CCK-8溶液。
 

　　4. 在37℃
，5% CO2
，90%濕度條件(jiàn)下(xià)培養(yǎng)0.5-4小(xiǎo)時(shí)。
 

　　5. 用(yòng)酶(méi)標儀(yí)在(zài)450 nm處(chǔ)測(cè)量吸光(guāng)度。
 

　　6. 用Excel及Graphpad Prism處(chǔ)理並(bìng)分(fēn)析結果(guǒ)。
 

　　7. 結(jié)果(guǒ)示例圖(tú)：

 

　　三
，關鍵(jiàn)注意事項與技(jì)巧

 

　　避免(miǎn)氣(qì)泡(pào)： 孔內(nèi)氣泡會(huì)嚴(yán)重幹擾讀(dú)數，加(jiā)樣(yàng)和(hé)檢測前可短(duǎn)暫(zàn)離心孔板以去(qù)除(chú)氣泡(pào)。
 

　　設置復(fù)孔： 建(jiàn)議每(měi)個(gè)實驗條(tiáo)件(jiàn)設(shè)置(zhì)至(zhì)少(shǎo)3個復孔，以確(què)保數據的(dí)統(tǒng)計學(xué)意義。
 

　　孵育時間(jiān)優化： 孵(fū)育時間(jiān)過長會(huì)導(dǎo)致顏(yán)色(sè)過深，超(chāo)出檢測(cè)綫性範圍(wéi);過短則信號(hào)太(tài)弱(ruò)。必須(xū)通過(guò)預實驗(yàn)摸索(suǒ)最(zuì)佳(jiā)時(shí)間。
 

　　購買(mǎi)建(jiàn)議
 

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　　活(huó)動時(shí)間：2025.10.14-2025.12.31
 

　　增(zēng)強(qiáng)型細(xì)胞(bāo)活力(lì)檢測試(shì)劑盒(CCK-8)
 

　　貨號(hào)：E-CK-A362
 

　　規格(gé):500T

 

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