細胞(bāo)凍(dòng)存(cún)是(shì)細胞保存的主要(yào)方(fāng)法(fǎ)之(zhī)一(yī)，利(lì)用(yòng)凍存(cún)技(jì)術將細胞冷(lěng)凍保存在-196℃液(yè)氮中(zhōng)，可以使(shǐ)細胞(bāo)暫時(shí)停止生(shēng)長(cháng)並保留細胞特(tè)性(xìng)，以(yǐ)便在需要時再(zài)復蘇細胞(bāo)用於(yú)實(shí)驗。同時保(bǎo)存(cún)適(shì)量(liáng)的(dí)細(xì)胞(bāo)，可(kě)以(yǐ)防(fáng)止細(xì)胞在培養過程中因(yīn)受到(dào)汙染(rǎn)或其他(tā)意外事件導致(zhì)細胞丟(diū)種，起(qǐ)到細(xì)胞(bāo)保(bǎo)種(zhǒng)的(dí)作用(yòng)。

細(xì)胞凍(dòng)存(cún)和復蘇采(cǎi)取“慢(màn)凍(dòng)快融"的(dí)原則(zé)，慢速冷(lěng)凍可(kě)使細(xì)胞(bāo)內的(dí)水(shuǐ)份滲出細(xì)胞外，減少(shǎo)細(xì)胞內(nèi)形成冰(bīng)晶(jīng)的機(jī)會(huì)
；快融以保(bǎo)證細(xì)胞外結(jié)晶(jīng)快(kuài)速融化，避(bì)免(miǎn)慢(màn)速融(róng)化(huà)水份滲入細胞內，再(zài)次形(xíng)成胞(bāo)內冰晶造(zào)成對細胞的損傷(shāng)。

細胞(bāo)凍(dòng)存(cún)時(shí)需向(xiàng)培養基中加(jiā)入(rù)冷凍保(bǎo)護劑，可保護(hù)細胞在冷(lěng)凍時免受溶(róng)液(yè)損傷和(hé)冰(bīng)晶損(sǔn)傷(shāng)。冷凍保護(hù)劑(jì)可(kě)根(gēn)據其是(shì)否(fǒu)穿透(tòu)細(xì)胞(bāo)膜分(fēn)為滲透性和非滲(shèn)透性兩(liǎng)類(lèi)：

1.滲透(tòu)性(xìng)冷(lěng)凍保(bǎo)護劑可(kě)以滲(shèn)透到細胞內(nèi)，一般(bān)是(shì)一些(xiē)小(xiǎo)分子物(wù)質，主(zhǔ)要(yào)包括甘油(yóu)，DMSO，乙二醇，丙二(èr)醇，乙(yǐ)酰胺(àn)，甲醇等(děng)。

2.非(fēi)滲透(tòu)性冷(lěng)凍(dòng)保(bǎo)護劑(jì)不能(néng)滲透到細(xì)胞(bāo)內，一般是些大(dà)分(fēn)子(zǐ)物(wù)質，主(zhǔ)要(yào)包(bāo)括(kuò)聚乙烯(xī)吡(pǐ)咯(kǎ)烷(wán)酮(tóng)（PVP），蔗(zhè)糖，聚(jù)乙(yǐ)二醇(chún)，葡(pú)聚(jù)糖，白(bái)蛋白(bái)以及(jí)羥(qiǎng)YI基澱(diàn)粉等。

（一）細胞凍存(cún)一(yī)般步驟

1. 準(zhǔn)備已滅(miè)菌的凍(dòng)存(cún)培(péi)養液，並(bìng)4℃預(yù)冷
；

2. 選(xuǎn)取對數生(shēng)長期的細(xì)胞(bāo)，棄掉細胞培(péi)養液，用細胞(bāo)消(xiāo)化(huà)酶（如胰(yí)蛋白(bái)酶）進行消化，適(shì)時(shí)去掉(diào)消(xiāo)化液，加入(rù)少量(liáng)新(xīn)鮮(xiān)培養(yǎng)液(yè)。懸浮生(shēng)長的(dí)細(xì)胞不進(jìn)行(háng)消(xiāo)化處(chǔ)理，直(zhí)接將(jiāng)細胞(bāo)收集(jí)於離心管中離心，1000 rpm，5-10 min
；

3. 棄去(qù)上清(qīng)液(yè)，逐漸加(jiā)入適量預(yù)冷的凍存培(péi)養液，用吸(xī)管(guǎn)輕輕吹打(dǎ)使細(xì)胞(bāo)均匀，計數(shù)，調節(jié)細胞(bāo)濃度(dù)在5×10⁶～1×10⁷/mL之(zhī)間
；

4. 將上(shàng)述細(xì)胞(bāo)分(fēn)裝(zhuāng)於(yú)2 mL凍存管中，每(měi)管1-1.5 mL。在凍(dòng)存管(guǎn)上(shàng)標(biāo)明(míng)細胞名稱(chēng)，凍(dòng)存日期(qī)和(hé)操(cāo)作(zuò)者
；

5. 凍(dòng)存：標(biāo)準的降溫(wēn)速率開始(shǐ)為(wéi)-1～-2℃/ min，當溫(wēn)度降到(dào)-80℃時，可迅速浸入液氮(dàn)中(zhōng)。也可(kě)將(jiāng)裝有(yǒu)細胞的凍存管放(fàng)入(rù)-20℃冰(bīng)箱2 h ，然後放入(rù)-80℃冰(bīng)箱中過夜(yè)，取出凍(dòng)存管，移(yí)入液(yè)氮容器內。

（二(èr)）注意事(shì)項

1. 配製好的細胞(bāo)凍存(cún)液要進(jìn)行(háng)預(yù)冷(lěng)，新鮮配製的凍存液(yè)會產生(shēng)大量(liáng)的熱。

2. 凍(dòng)存(cún)的細胞(bāo)在半年後，建議(yì)取出一(yī)隻凍(dòng)存管細(xì)胞(bāo)復蘇(sū)培養(yǎng)，觀(guān)察生(shēng)長(cháng)情(qíng)況(kuàng)，然後再繼續凍(dòng)存(cún)。