你知道內切酶實(shí)驗(yàn)的注意事(shì)項(xiàng)有(yǒu)哪(nǎ)些嗎(má)？讓我(wǒ)們(mén)一(yī)起(qǐ)來看看吧！

一(yī)，限製性(xìng)內(nèi)切(qiē)酶(méi)一般反(fǎn)應(yīng)條件(jiàn)

當(dāng)進行限製(zhì)性酶(méi)切反應(yīng)時(shí)，為確保最(zuì)佳(jiā)的(dí)反應(yīng)條(tiáo)件(jiàn)，務必要遵守限製性內切酶(méi)供應商提(tí)供的建議(yì)。在(zài)此過(guò)程中(zhōng)需(xū)要(yào)考(kǎo)慮(lǜ)的(dí)重要參數包(bāo)括(kuò)：底物(wù) (DNA) 和酶的(dí)量(liáng)，反應(yīng)體(tǐ)積(jī)以及孵育時(shí)間。

根據(jù)傳(chuán)統的(dí)定義(yì)，在最佳(jiā)反(fǎn)應條件(jiàn)下(xià)，一個單位(wèi)的(dí)限製性內(nèi)切(qiē)酶可(kě)以在1小(xiǎo)時內，在50μL體係中 wan全酶(méi)切1μL 定義底(dǐ)物（例如，質粒 pUC19）。盡(jìn)管單位(wèi)定義(yì)提供了(liǎo)一種測定方(fāng)式(shì)，但還需注(zhù)意，根據 DNA 底物之(zhī)中的識別序列出(chū)現(xiàn)的(dí)頻率(shuài)及所(suǒ)用底(dǐ)物類(lèi)型，針(zhēn)對(duì)不(bù)同(tóng)DNA底物使(shǐ)用(yòng)等量的(dí)限(xiàn)製性內切(qiē)酶可能需(xū)要不(bù)同(tóng)的最佳反應條件。實際(jì)上，酶供應商(shāng)往往根據 DNA 樣本(běn)的(dí)潛在質量，數量和(hé)性(xìng)質波動，推(tuī)薦(jiàn)比wan全(quán)酶切所需量(liáng)多5至20倍的(dí)酶(méi)（或1μL 酶/反應體積）。

二(èr)，星號活性(xìng)

星號或“鬆弛(chí)"活性(xìng)是限製性內切酶(méi)的(dí)一種(zhǒng)固有性質，即在非最you反應(yīng)條件下(xià)，限(xiàn)製性(xìng)內(nèi)切(qiē)酶可能(néng)會作用(yòng)於(yú)與其天然識(shí)別位(wèi)點(diǎn)存在細微差(chà)異(yì)的識別序列。例(lì)如(rú)，如(rú)下(xià)圖所示(shì)，EcoRI 可(kě)以(yǐ)識(shí)別和切(qiē)割位點5’-GAATTC-3’，但其(qí)星號(hào)活性可能導(dǎo)致序列(liè)在5’-TAATTC-3’和(hé)5’-CAATTC-3’處被切(qiē)割。同樣(yàng)，BamHI 除了可(kě)切割其(qí)正(zhèng)常的(dí)識別(bié)序列 5’-GGATCC-3’ 外，還可(kě)切割(gē) 5’-NGATCC-3’，5’-GPuATCC-3’和 5’-GGNTCC-3’（其中 N 代表任意(yì)核(hé)苷(gān)酸(suān)）。

需(xū)特別指出，在最佳(jiā)反應條件(jiàn)下，“星(xīng)號"位(wèi)點(diǎn)的(dí)切割率(shuài)要遠遠低(dī)於(yú)正常的識(shí)別位點（大(dà)約相(xiāng)差(chà) 105–106）。因此，酶切期(qī)間出現(xiàn)星(xīng)號(hào)活(huó)性(xìng)的常見(jiàn)原(yuán)因(yīn)為(wéi)限(xiàn)製性內切酶過(guò)量和/或孵育(yù)時(shí)間(jiān)過(guò)長(cháng)（過(guò)度(dù)酶切(qiē)）。此外，高(gāo)濃度(dù)甘油（例如，>5%），低(dī)濃度鹽(yán)，非最佳 pH，存在有(yǒu)機溶劑，以(yǐ)及(jí)除 Mg2+ 之(zhī)外的二(èr)價陽離子都可(kě)能(néng)造(zào)成底物(wù) DNA 的(dí)非特(tè)異性切割(gē)。使用酶製(zhì)造商(shāng)推薦的實驗(yàn)方(fāng)案和緩(huǎn)衝液，可(kě)避免(miǎn)出現星號活性(xìng)。

三，不wan全酶切

不(bù)wan全(quán)酶切是在(zài)限製(zhì)性(xìng)內(nèi)切酶(méi)使用過(guò)程中(zhōng)常遇到的問(wèn)題(tí)之(zhī)一(yī)。當酶量過(guò)多或過少(shǎo)時，都(dū)可能發生不(bù)wan全(quán)酶切。DNA 樣本中存在(zài)汙染(rǎn)物也可能(néng)導(dǎo)致不(bù)wan全(quán)酶切。緩衝(chōng)液組(zǔ)分，孵(fū)育(yù)時間和(hé)反(fǎn)應(yīng)溫度等(děng)欠佳的反應條件(jiàn)是不wan全酶切(qiē)的(dí)常見原因。

部分(fēn)限製(zhì)性內切酶需(xū)要輔因子才能實(shí)現wan全(quán)活性。例(lì)如，Esp3I (BsmBI) 需要 DTT，而(ér) Eco57I (AcuI) 需要(yào) S-腺苷甲硫胺酸(suān)。AarI 和 BveI (BspMI) 等部分限製(zhì)性內切(qiē)酶需要(yào)兩個(gè)拷(kǎo)貝的識別位(wèi)點(diǎn)才能(néng)實(shí)現有(yǒu)效(xiào)切割；針(zhēn)對這一(yī)類酶(méi)，通常向(xiàng)反(fǎn)應(yīng)物之(zhī)中添(tiān)加(jiā)一份帶(dài)有(yǒu)識別(bié)位點(diǎn)的(dí)寡核苷酸(suān)來增(zēng)強酶(méi)活性。

除(chú)了(liǎo)反應條(tiáo)件和(hé)酶性(xìng)質外，DNA 自身的(dí)性(xìng)質(zhì)也會(huì)影(yǐng)響(xiǎng)限(xiàn)製(zhì)性(xìng)酶切(qiē)。甲(jiǎ)基化的(dí) DNA 可耐受部分限製(zhì)性內(nèi)切酶(méi)的切(qiē)割（詳(xiáng)見(jiàn)甲(jiǎ)基化(huà)部分）。酶的識(shí)別(bié)位點過(guò)於(yú)接近(jìn)終端(duān)（綫性(xìng)底(dǐ)物 DNA 中(zhōng)）以及(jí)切割(gē)位(wèi)點相(xiāng)鄰(lín)（雙酶(méi)切）都(dū)可(kě)能(néng)影響(xiǎng)酶切(qiē)割 DNA 的(dí)效(xiào)率）。此(cǐ)外，部(bù)分超螺旋 DNA 分(fēn)子要(yào)比(bǐ)綫性 DNA 分子(zǐ)更難(nán)切割，增(zēng)加 5-10 倍(bèi)的酶(méi)量(liáng)可有助(zhù)實(shí)現wan全(quán)酶切。

四，酶(méi)切圖譜(pǔ)不(bù)正常

即(jí)便遵(zūn)守了製造商的(dí)使用(yòng)說(shuō)明(míng)，仍(réng)可(kě)能(néng)觀察到(dào)預料之外的(dí)底物 DNA 切(qiē)割結(jié)果(guǒ)。為避免陷入(rù)此類困(kùn)境(jìng)，必(bì)須(xū)確(què)保酶和 DNA，反應所用的試劑(jì)均(jūn)不(bù)含汙(wū)染物(wù)（例(lì)如(rú)，其它限製性(xìng)內(nèi)切酶，DNA 和核(hé)酸(suān)酶(méi)）。

出現預料之外切(qiē)割的一(yī)個原(yuán)因是，在增殖(zhí)和擴增(zēng)過程(chéng)中，底(dǐ)物 DNA 引(yǐn)入了(liǎo)突(tū)變。突變可能破(pò)壞(huài)已(yǐ)知(zhī)的(dí)識別位點或創造出新(xīn)的(dí)識(shí)別位點，從而(ér)產(chǎn)生預料之(zhī)外的酶切結(jié)果(guǒ)。對 DNA 進(jìn)行Sanger 測(cè)序(xù)，是(shì)一(yī)種(zhǒng)判斷(duàn)突(tū)變(biàn)是(shì)否引(yǐn)起底物 DNA 出(chū)現預期(qī)外(wài)切割(gē)的(dí)有(yǒu)效方法。

有(yǒu)時候預期(qī)之外的酶(méi)切圖譜(pǔ)是由(yóu)檢測過(guò)程(chéng)而非(fēi)酶(méi)切(qiē)過程造成(chéng)的(dí)。部分(fēn)限(xiàn)製(zhì)性內(nèi)切(qiē)酶（例如(rú)，FokI，TauI）可能(néng)會與(yǔ) DNA 緊(jǐn)密結(jié)合(hé)，導致電(diàn)泳時(shí)出(chū)現明顯(xiǎn)的凝膠遷(qiān)移(yí)。使用(yòng)含(hán) SDS 的(dí)上樣(yàng)染料(liào)，加熱使酶(méi)從(cóng)切(qiē)割(gē)的 DNA 上(shàng)解離開(kāi)來，均(jūn)可避免(miǎn)出(chū)現(xiàn)這類(lèi)凝膠遷移現象。

更多有關(guān)內切酶(méi)實(shí)驗的(dí)注(zhù)意(yì)事(shì)項，請聯(lián)係(xì)天津益(yì)元(yuán)利康生物科(kē)技(jì)有限公司：