聚合(hé)酶(méi)鏈式(shì)反(fǎn)應產(chǎn)物中通常會(huì)含(hán)有過量的(dí)引物，dNTP，酶等，這(zhè)些會(huì)對後續核(hé)酸序(xù)列(liè)測定，酶切，載體構建等(děng)產生影(yǐng)響，通過(guò)PCR純(chún)化回收可(kě)獲(huò)取純的DNA擴增產(chǎn)物。那(nà)麼PCR純(chún)化回收(shōu)的步驟(zhòu)與注意(yì)事(shì)項有(yǒu)哪些(xiē)呢？讓我(wǒ)們一(yī)起來看看吧！

一，步(bù)驟(zhòu)

1.在(zài)紫(zǐ)外投(tóu)射儀或(huò)凝膠(jiāo)成(chéng)像儀(yí)上(shàng)，用刀片切(qiē)取(qǔ)包(bāo)含目(mù)的(dí)條帶(dài)的瓊脂(zhī)糖凝膠(jiāo)並稱重(zhòng)；

2.一(yī)般(bān)以0.1g膠(jiāo)加(jiā)入100μl溶膠(jiāo)液的比(bǐ)例（具體(tǐ)根(gēn)據試劑(jì)盒(hé)說明添加），按凝(níng)膠實際重量(liáng)加入溶膠液(yè)，水浴鍋中55℃溶(róng)膠(jiāo)（期間(jiān)可(kě)緩慢震(zhèn)動Ep管，將膠(jiāo)溶(róng)解wan全）；

3.回收試(shì)劑(jì)盒(hé)中會(huì)配(pèi)有回收柱(zhù)和廢液管，將溶(róng)解(jiě)好(hǎo)的溶液加入回收(shōu)柱(zhù)中，並(bìng)將回(huí)收柱套入2ml廢液(yè)管(guǎn)中；

4.12000r/min離心30-60s，去除廢(fèi)液(yè)；

5.將(jiāng)500μl漂(piāo)洗液加(jiā)入回收柱，並將回(huí)收柱重(zhòng)新套(tào)入2ml廢(fèi)液管中(zhōng)，12000r/min離心60-90s，去(qù)除廢(fèi)液；

6.重復漂洗一次去除(chú)廢液(yè)；

7.12000r/min離(lí)心(xīn)2min，將(jiāng)回(huí)收柱套(tào)入高(gāo)壓滅菌後的(dí)1.5mlEp管中；

8.向回(huí)收柱(zhù)正中(zhōng)央(yāng)的濾膜(mó)上(shàng)滴加20-30μl洗(xǐ)脫(tuō)buffer或高(gāo)壓滅(miè)菌ddH2O，靜(jìng)置5-15min；

9.12000r/min離心90-120s；

10.將1.5mlEp管(guǎn)中的回收產物再次滴(dī)入到回收柱中央(yāng)的濾(lǜ)膜(mó)上，或向(xiàng)濾膜中央(yāng)再(zài)加(jiā)10μl洗(xǐ)脫(tuō)buffer或(huò)高壓(yā)滅菌(jūn)ddH2O，繼(jì)續靜置5-15min；

11.12000r/min離心120s，1.5mlEp管中收集到的(dí)溶(róng)液(yè)即(jí)為(wéi)純化(huà)回(huí)收的(dí)PCR產物(wù)。

二(èr)，注意(yì)事(shì)項(xiàng)

1. 切(qiē)取的(dí)包(bāo)含目的(dí)條帶的瓊脂(zhī)糖(táng)凝(níng)膠(jiāo)需(xū)稱重(zhòng)，並按照試劑盒說明要(yào)求(qiú)按(àn)比(bǐ)例(lì)添(tiān)加(jiā)溶(róng)膠(jiāo)液；

2. 溶膠需(xū)充分(fēn)；

3. 回(huí)收管，ddH2O要(yào)提前高(gāo)壓(yā)滅菌；

4. 為盡量(liáng)提高回收(shōu)率可以(yǐ)將回(huí)收產(chǎn)物再次(cì)過(guò)柱(zhù)，離(lí)心(xīn)。

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