熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的(dí)分子(zǐ)細(xì)胞遺(yí)傳學(xué)技術，是 20 世(shì)紀(jì) 80 年代末(mò)期(qī)在原(yuán)有(yǒu)的放(fàng)射(shè)性(xìng)原位雜交技術的(dí)基礎(chǔ)上(shàng)發展起來(lái)的一種非放(fàng)射性(xìng)原位雜(zá)交技(jì)術。那麼你知(zhī)道熒(yíng)光原(yuán)位雜交（FISH）的(dí)實驗(yàn)步(bù)驟是什(shí)麼嗎？讓(ràng)我們(mén)一起(qǐ)來(lái)看(kàn)看(kàn)吧(bā)！

一(yī)，實驗材料(liào)準備

1. 實驗用具(jù)及材料

（1）人(rén)的(dí) MyoD1（MYF3)基因探，人外周(zhōu)血中(zhōng)期(qī)染色體細胞標(biāo)本(běn)；

（2）指甲油，甲酰胺，氯化鈉，檸檬酸鈉，*，吐溫 20 等(děng)；

（3）恒溫水浴(yù)鍋，培(péi)養(yǎng)箱，染色缸(gāng)，載(zǎi)玻(bō)片，Nikon E-400 熒(yíng)光顯微(wēi)鏡(jìng)，蓋(gài)玻片，封口膜，200μL移液器，暗(àn)盒(hé)等(děng)。

二，實(shí)驗方法及步驟

1. 探針變性

將探針在 75℃恒(héng)溫水(shuǐ)浴中(zhōng)溫育(yù) 5 min，立(lì)即置 0℃，5～10 min，使雙(shuāng)鏈(liàn) DNA 探針(zhēn)變性。

2. 標本變性(xìng)

（1）將製備(bèi)好的(dí)染(rǎn)色體(tǐ)玻片標(biāo)本於(yú) 50℃培(péi)養(yǎng)箱(xiāng)中烤片 2～3 h。（經(jīng) Giemsa 染(rǎn)色的標(biāo)本(běn)需預先(xiān)在(zài)固(gù)定液中(zhōng)退色(sè)後再烤片(piàn)）。

（2）取出(chū)玻(bō)片(piàn)標本，將(jiāng)其浸(jìn)在 70～75℃的體積(jī)分數 70% 甲酰(xiān)胺/2×SSC 的變性(xìng)液中變性2～3 min。

（3）立即按(àn)順(shùn)序(xù)將標(biāo)本(běn)經體積分數 70%，體積分數(shù) 90%和(hé)體積分數(shù) 100%冰(bīng)乙醇係(xì)列脫水，每次 5 min，然(rán)後空(kōng)氣幹燥。

3. 雜交(jiāo)

將已變性或預退火的 DNA 探(tàn)針 10 μL 滴(dī)於已(yǐ)變性並(bìng)脫(tuō)水(shuǐ)的(dí)玻片(piàn)標本(běn)上(shàng)，蓋上 18×18 蓋(gài)玻(bō)片，用(yòng) Parafilm 封(fēng)片(piàn)，置於潮濕暗(àn)盒中 37℃雜交(jiāo)過夜（約(yuē) 15～17 h）。由(yóu)於(yú)雜交液(yè)較少(shǎo)，而且雜交(jiāo)溫度較(jiào)高，持續時(shí)間(jiān)又(yòu)長，因(yīn)此(cǐ)為了保(bǎo)持(chí)標本的濕(shī)潤狀(zhuàng)態，此(cǐ)過程(chéng)在(zài)濕盒中進(jìn)行。

4. 洗脫(tuō)

此步(bù)驟(zhòu)有助於(yú)除(chú)去非特異性結合(hé)的探(tàn)針(zhēn)，從(cóng)而降低本底(dǐ)。

（1） 雜交(jiāo)次(cì)日，將(jiāng)標本從(cóng) 37℃溫(wēn)箱(xiāng)中取出，用(yòng)刀(dāo)片輕(qīng)輕(qīng)將(jiāng)蓋(gài)玻(bō)片揭(jiē)掉(diào)。

（2） 將已(yǐ)雜交(jiāo)的(dí)玻(bō)片標(biāo)本(běn)放(fàng)置(zhì)於已(yǐ)預(yù)熱 42～50℃的體(tǐ)積(jī)分數 50%甲酰(xiān)胺(àn)/2×SSC 中洗滌(dí)3 次，每次 5 min。

（3） 在(zài)已預(yù)熱(rè) 42～50℃的 1×SSC 中(zhōng)洗(xǐ)滌(dí) 3 次，每次(cì) 5 min。

（4） 在室溫(wēn)下(xià)，將(jiāng)玻片(piàn)標本於(yú) 2×SSC 中(zhōng)輕洗一下。

（5） 取出玻片，自然(rán)幹燥。

（6） 取 200 μL 復染(rǎn)溶液（PI/antifade 或 DAPI/antifade 染液）滴加在(zài)玻(bō)片標本上，蓋上蓋玻片。

5. 雜交(jiāo)信號(hào)的(dí)放大（適用(yòng)於使用生(shēng)物(wù)素(sù)標(biāo)記的(dí)探針(zhēn)）

（1） 在(zài)玻(bō)片(piàn)的雜(zá)交(jiāo)部(bù)位加(jiā) 150 μL 封閉液 I，用保(bǎo)鮮(xiān)膜覆蓋，37℃溫育(yù) 20min。

（2） 去(qù)掉(diào)保(bǎo)鮮膜，再(zài)加(jiā) 150 μL avidin-FITC 於標(biāo)本上(shàng)，用保(bǎo)鮮膜(mó)覆蓋，37℃繼續(xù)溫育(yù) 40 min。

（3） 取(qǔ)出(chū)標(biāo)本(běn)，將(jiāng)其(qí)放(fàng)入(rù)已預熱(rè) 42～50℃的(dí)洗脫(tuō)液(yè)中洗滌 3 次，每(měi)次 5 min。

（4） 在(zài)玻片標本(běn)的雜(zá)交(jiāo)部位加(jiā) 150 μL 封(fēng)閉(bì)液(yè) II，覆(fù)蓋(gài)保鮮(xiān)膜，37℃溫育 20 min。

（5） 去掉保(bǎo)鮮膜(mó)，加 150 μL antiavidin 於標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮(xiān)膜(mó)，37℃溫育 40 min。

（6） 取(qǔ)出標本(běn)，將(jiāng)其放入已(yǐ)預熱 42～50℃的(dí)新洗脫(tuō)液(yè)中(zhōng)，洗滌 3 次，每次 5 min。

（7） 重復步驟(zhòu)（1），（2），（3），再於(yú) 2×SSC 中室(shì)溫清洗(xǐ)一(yī)下。

（8） 取(qǔ)出玻片，自然幹燥。

（9） 取(qǔ) 200 μL PI/antifade 染液滴加在(zài)玻片標(biāo)本(běn)上(shàng)，蓋(gài)上蓋玻(bō)片(piàn)。

6. 封片

可采用(yòng)不同類(lèi)型(xíng)的封片液。如(rú)果(guǒ)封片液(yè)中不含(hán)有 Mowiol（可使封(fēng)片液產生自(zì)封閉(bì)作用），為防止(zhǐ)蓋片(piàn)與載(zǎi)片之(zhī)間(jiān)的溶液揮(huī)發，可(kě)使用指(zhǐ)甲(jiǎ)油(yóu)將(jiāng)蓋片(piàn)周圍封閉。封好的玻片標本(běn)可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持(chí)數(shù)月之久(jiǔ)。

7. 熒光(guāng)顯微鏡觀察(chá) FISH 結果

先(xiān)在(zài)可見(jiàn)光(guāng)源下找到(dào)具有(yǒu)細(xì)胞分裂(liè)相的視野，然(rán)後打開(kāi)熒(yíng)光激發光(guāng)源，FITC 的激發波(bō)長(cháng)為(wéi)490 nm。細胞被(bèi) PI 染成紅色，而經(jīng) FITC 標(biāo)記的(dí)探針所在(zài)的位(wèi)置(zhì)發出(chū)綠色(sè)熒(yíng)光。

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