優質的試(shì)劑(jì)，良(liáng)好(hǎo)的(dí)儀器(qì)和正確(què)的操作是(shì)保(bǎo)證 ELISA 檢(jiǎn)測(cè)結(jié)果(guǒ)準(zhǔn)確(què)可靠的必要條件(jiàn)
。ELISA的(dí)操作因固相載體的(dí)形成不(bù)同而(ér)有所差(chà)異(yì)，那麼你知道ELISA實(shí)驗的操(cāo)作(zuò)要(yào)點有什麼嗎？讓我們(mén)一起來(lái)看(kàn)看吧！

一(yī)
，標本的采取(qǔ)和保(bǎo)存

可(kě)用作(zuò) ELISA 測(cè)定(dìng)的(dí)標(biāo)本十(shí)分廣泛，體(tǐ)液(如(rú)血清(qīng))
，分泌(mì)物(wù)(唾液)和排泄物(wù)(如尿(niào)液
，糞便)等(děng)均(jūn)可作(zuò)標(biāo)本(běn)以測定(dìng)其(qí)中(zhōng)某種抗體(tǐ)或(huò)抗原成(chéng)份
。有(yǒu)些(xiē)標本可直(zhí)接進行測(cè)定(如血清
，尿(niào)液(yè))，有些(xiē)則(zé)需經預處理(如(rú)糞便和(hé)某(mǒu)些(xiē)分泌物(wù))
。大部(bù)分 ELISA 檢測均(jūn)以血(xiě)清為(wéi)標本(běn)
。血漿中(zhōng)除尚(shàng)含有纖維蛋白原(yuán)和抗(kàng)凝劑(jì)外，其(qí)他成份均同等於(yú)血清(qīng)
。製備(bèi)血漿(jiāng)標(biāo)本(běn)需借(jiè)助(zhù)於抗凝劑(jì)，而(ér)血(xiě)清(qīng)標(biāo)本隻(zhī)要待(dài)血(xiě)清自(zì)然(rán)凝(níng)固(gù)
，血(xiě)kuai收(shōu)縮後(hòu)即可取得
。除(chú)特殊情(qíng)況外，在(zài)醫學檢(jiǎn)驗中均以(yǐ)血(xiě)清(qīng)作為檢(jiǎn)測標本
。在(zài) ELISA 中(zhōng)血(xiě)漿和血清可(kě)同等應用
。血(xiě)清標本可按(àn)常(cháng)規方(fāng)法(fǎ)采集(jí)，應注意避(bì)免溶血，紅細(xì)胞溶(róng)解時(shí)會釋放(fàng)出具有過(guò)氧(yǎng)化(huà)物酶(méi)活性的(dí)物質，以 HRP 為標記的 ELISA 測定中，溶血(xiě)標(biāo)本可能會增加非特異性顯色
。血(xiě)清標本(běn)宜在新(xīn)鮮時檢(jiǎn)測
。如(rú)有(yǒu)細菌汙染，菌體(tǐ)中可(kě)能(néng)含(hán)有(yǒu)內源性(xìng) HRP，也會產生假(jiǎ)陽性反應(yīng)
。如(rú)在冰箱(xiāng)中保存(cún)過(guò)久(jiǔ)，其中的(dí)可(kě)發生聚(jù)合，在(zài)間接(jiē)法 ELISA 中(zhōng)可使本(běn)底(dǐ)加深(shēn)
。一般說(shuō)來(lái)，在(zài)5 天(tiān)內測定(dìng)的(dí)血(xiě)清(qīng)標(biāo)本(běn)可(kě)放置於4℃，超過(guò)一(yī)周測定的需低溫冰存(cún)
。凍結(jié)血(xiě)清融(róng)解(jiě)後，蛋白(bái)質(zhì)局部(bù)濃(nóng)縮(suō)，分布(bù)不均，應充分(fēn)混匀(yún)宜輕(qīng)緩(huǎn)，避(bì)免氣(qì)泡，可(kě)上(shàng)下(xià)顛倒(dǎo)混(hùn)和，不要(yào)在混(hùn)匀器(qì)上(shàng)強(qiáng)烈振蕩
。混濁(zhuó)或(huò)有沉澱的(dí)血清標本應(yīng)先離(lí)心或過濾(lǜ)，澄清(qīng)後(hòu)再檢(jiǎn)測(cè)
。反(fǎn)復凍融會使抗體效價(jià)跌落(là)，所以測(cè)抗體的血(xiě)清標本(běn)如需(xū)保存作(zuò)多次檢測(cè)，宜少量分(fēn)裝冰存
。保(bǎo)存血清自采集(jí)時(shí)就(jiù)應注意無菌(jūn)操(cāo)作，也可加入適當(dāng)防腐劑(jì)
。

二
，試(shì)劑(jì)的(dí)準(zhǔn)備(bèi)

按試(shì)劑盒(hé)說明(míng)書的(dí)要求(qiú)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中(zhōng)需用的(dí)試(shì)劑
。ELISA 中(zhōng)用(yòng)的(dí)蒸(zhēng)餾水或(huò)去(qù)離子(zǐ)水，包(bāo)括用於洗(xǐ)滌(dí)的，應(yīng)為(wéi)新鮮的和(hé)高質量的(dí)
。自(zì)配的(dí)緩衝液(yè)應(yīng)用(yòng) pH 計測(cè)量(liáng)較正
。從(cóng)冰(bīng)箱(xiāng)中取(qǔ)出(chū)的試(shì)驗(yàn)用試(shì)劑應(yīng)待溫度(dù)與(yǔ)室溫平衡後使(shǐ)用(yòng)
。試劑(jì)盒中本次試(shì)驗不需(xū)用的(dí)部分(fēn)應及時(shí)放回冰箱(xiāng)保(bǎo)存
。

三
，加(jiā)樣

在 ELISA 中(zhōng)一般有3次加樣(yàng)步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合(hé)物，加(jiā)底物(wù)
。加樣(yàng)時應將(jiāng)所加物(wù)加(jiā)在 LEISA 板孔的底部(bù)，避(bì)免加(jiā)在孔壁上部，並注(zhù)意不(bù)可(kě)濺出(chū)，不(bù)可(kě)產生氣泡(pào)
。加(jiā)標(biāo)本一(yī)般用微量(liáng)加樣(yàng)器，按(àn)規(guī)定的量加入板孔中(zhōng)
。每次(cì)加(jiā)標(biāo)本(běn)應(yīng)更(gēng)換(huàn)吸嘴(zuǐ)，以免(miǎn)發生交叉汙染，也可用一次性的定量塑料(liào)管加(jiā)樣
。有此測(cè)定(dìng)(如(rú)間(jiān)接法 ELISA)需用稀(xī)釋的(dí)血清，可(kě)在(zài)試(shì)管(guǎn)中(zhōng)按(àn)規定的稀(xī)釋(shì)度稀釋後(hòu)再加樣(yàng)
。也(yě)可在板孔(kǒng)中加入稀釋液，再(zài)在(zài)其中加入血清標本(běn)，然(rán)後(hòu)在(zài)微(wēi)型震蕩器(qì)上(shàng)震蕩 1 分(fēn)鐘以(yǐ)保(bǎo)證(zhèng)混和(hé)
。加酶(méi)結合物(wù)應(yīng)用液(yè)和底物(wù)應(yīng)用液時(shí)可(kě)用定量多(duō)道加液器，使加液(yè)過(guò)程迅(xùn)速完成
。

四
，保(bǎo)溫

在ELISA中(zhōng)一般有兩次抗(kàng)原抗體(tǐ)反(fǎn)應，即加(jiā)標(biāo)本和加(jiā)酶(méi)結(jié)合物後(hòu)
。抗(kàng)原抗體反應(yīng)的完(wán)成(chéng)需要(yào)有一定(dìng)的溫度(dù)和時間(jiān)，這一保(bǎo)溫(wēn)過程稱為溫(wēn)育(yù)(incubation)，有人稱之為孵(fū)育，在(zài) ELISA中似不恰(qià)當(dāng)
。ELISA 屬固相免(miǎn)疫測定(dìng)，抗(kàng)原(yuán)
，抗體的結(jié)合(hé)隻(zhī)在固相(xiāng)表麵上(shàng)發生(shēng)
。以抗(kàng)體包被的夾心(xīn)法為例(lì)，加(jiā)入板(bǎn)孔(kǒng)中(zhōng)的(dí)標本，其中的抗(kàng)原並不是(shì)都有均(jūn)等(děng)的(dí)和固(gù)相(xiāng)抗(kàng)結合(hé)的(dí)機(jī)會(huì)，隻有(yǒu)最(zuì)貼近孔壁(bì)的一(yī)層溶液中(zhōng)的(dí)抗原直接與抗體接(jiē)觸(chù)
。這是一個逐(zhú)步平衡的過(guò)程(chéng)，因此需(xū)經(jīng)擴(kuò)散才能(néng)達到(dào)反(fǎn)應的終點
。在(zài)其(qí)後加入的(dí)酶標記(jì)抗體與(yǔ)固相(xiāng)抗原的結合(hé)也(yě)同樣(yàng)如此(cǐ)
。這就是(shì)為什麼 ELISA反(fǎn)應總(zǒng)是需要一定(dìng)時間的溫(wēn)育
。

溫育常(cháng)采用(yòng)的溫度有 43℃
，37℃
，室溫和(hé) 4℃(冰箱溫(wēn)度)等(děng)
。37℃是(shì)實(shí)驗(yàn)室(shì)中(zhōng)常用的保溫溫度(dù)，也是大(dà)多數(shù)抗(kàng)原抗體(tǐ)結合(hé)的合適溫度(dù)
。在(zài)建立 ELISA 方法作(zuò)反應(yīng)動(dòng)力(lì)學研究(jiū)時，實驗(yàn)表明(míng)，兩次抗(kàng)原(yuán)抗體反(fǎn)應(yīng)一般在 37℃經 1-2 小時，產(chǎn)物(wù)的生成可達ding峰
。為(wéi)加(jiā)速反(fǎn)應，可(kě)提(tí)高(gāo)反(fǎn)應的溫度(dù)，有些(xiē)試驗在 43℃進行，但不宜采用(yòng)更高的(dí)溫度
。抗(kàng)原抗體(tǐ)反應 4℃更為徹di，在放射免疫測定中(zhōng)多(duō)使反應在冰(bīng)箱中(zhōng)過夜(yè)，以形(xíng)成最多(duō)的沉澱
。但因所需時(shí)間(jiān)太長，在 ELISA 中一般(bān)不予(yú)采用
。

五(wǔ)
，洗滌(dí)

洗滌(dí)在ELISA過(guò)程(chéng)中雖不是(shì)一個反應(yīng)步驟，但卻也決(jué)定(dìng)著實驗的成(chéng)敗
。ELSIA就是靠洗滌來(lái)達到分(fēn)離遊離(lí)的和結合(hé)的(dí)酶標記(jì)物的(dí)目的
。通(tōng)過(guò)洗(xǐ)滌以清除殘(cán)留在(zài)板孔中沒(méi)能(néng)與固相抗原或抗(kàng)體結合(hé)的(dí)物質，以及在反應過程(chéng)中(zhōng)非特(tè)異(yì)性(xìng)地吸(xī)附於(yú)固(gù)相(xiāng)載體的幹(gān)擾物質(zhì)
。聚(jù)苯(běn)乙烯等塑料(liào)對蛋白質的(dí)吸附是(shì)普遍性(xìng)的，而在洗(xǐ)滌(dí)時又應把這(zhè)種非(fēi)特異性(xìng)吸附的幹擾(rǎo)物(wù)質(zhì)洗滌(dí)下來
。可以(yǐ)說(shuō)在ELISA操作中(zhōng)，洗滌(dí)是(shì)最主(zhǔ)要的關鍵技術，應引起(qǐ)操(cāo)作者的高度重視(shì)，操作者應嚴格按(àn)要(yào)求洗(xǐ)滌(dí)，不得(dé)馬虎
。

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