你知(zhī)道RNA提取準(zhǔn)備(bèi)工(gōng)作(zuò)及(jí)注意(yì)事項都有(yǒu)什麼(mó)嗎？讓(ràng)我們(mén)一(yī)起(qǐ)來(lái)看看(kàn)吧！

一(yī)，槍(qiāng)頭(tóu)和(hé)EP管等的消(xiāo)毒滅菌

1. 用去離(lí)子(zǐ)水配製0.1%（千(qiān)分(fēn)之(zhī)一）的DEPC（劇(jù)毒(dú)物），須在通(tōng)風(fēng)櫥中(zhōng)小(xiǎo)心(xīn)使用(yòng)，避(bì)光密閉(bì)4℃保存;

DEPC水(shuǐ)是用DEPC處理過(guò)並經(jīng)高溫高(gāo)壓消(xiāo)毒的純水(shuǐ)。經(jīng)檢(jiǎn)測不含(hán)RNase，DNase和(hé)proteinase。

2. 將槍(qiāng)頭和EP管(guǎn)放入0.1%的(dí)DEPC內(nèi)，保證(zhèng)槍(qiāng)頭和(hé)EP管(guǎn)內都(dū)充滿0.1%的DEP。

3. 避(bì)光，靜(jìng)置(zhì)，過夜（12-24h）

4. 裝(zhuāng)槍頭和EP管的盒(hé)子不(bù)需(xū)要(yào)用DEPC浸(jìn)泡(pào)，將槍(qiāng)頭或者(zhě)EP管(guǎn)內(nèi)的(dí)DEPC水(shuǐ)大(dà)致去除幹後，裝起，包(bāo)好(hǎo)

5. 121攝(shè)氏度(dù)，30min

6. 180攝氏(shì)度(dù)，幹燥(zào)數個鐘頭（至(zhì)少3小時(shí)以上(shàng)）

注意：a，處(chǔ)理DEPC時需(xū)要(yào)戴乳膠手(shǒu)套，口罩(zhào)！b，或者不(bù)用(yòng)DEPC消(xiāo)毒(dú)，130℃，90min高壓(yā)滅(miè)菌（許(xǔ)多實驗室高溫(wēn)滅(miè)菌(jūn)兩次）

RNA提(tí)取(qǔ)注(zhù)意事(shì)項(xiàng)

二，組(zǔ)織(zhī) RNA 抽(chōu)提失敗的現(xiàn)象(xiàng)

RNA降解(jiě)和組織(zhī)內(nèi)雜質(zhì)的(dí)殘留，關於降(jiàng)解(jiě)問題，首先看(kàn)一下為什麼從培(péi)養細胞中(zhōng)抽提(tí)RNA不容(róng)易降(jiàng)解(jiě)。現有(yǒu)的(dí)RNA抽提(tí)試(shì)劑(jì)，都含有快速抑(yì)製(zhì)Rnase的(dí)成分(fēn)。在培(péi)養細(xì)胞中加入(rù)裂(liè)解液(yè)，簡單(dān)的混匀，即(jí)可(kě)使(shǐ)所有(yǒu)的細胞與裂(liè)解(jiě)液(yè)充分混匀，細胞被徹(chè)di裂解。細胞(bāo)被(bèi)裂(liè)解後，裂(liè)解(jiě)液中的(dí)有(yǒu)效成分(fēn)立即(jí)抑(yì)製住(zhù)細胞(bāo)內(nèi)的Rnase，所(suǒ)以(yǐ)RNA得以(yǐ)保(bǎo)持完整(zhěng)。也(yě)就是(shì)說，培(péi)養(yǎng)細胞由(yóu)於(yú)很容易(yì)迅(xùn)速(sù)與(yǔ)裂(liè)解液充分接觸(chù)，所以(yǐ)其(qí)RNA不容易(yì)被降解；反(fǎn)過來講，組(zǔ)織中(zhōng)的(dí)RNA之(zhī)所以容易(yì)被降(jiàng)解(jiě)，是因(yīn)為組織中的(dí)細胞(bāo)不容易迅速與裂(liè)解(jiě)液充(chōng)分接(jiē)觸(chù)所(suǒ)致。因此，假定有一(yī)種辦(bàn)法，在抑(yì)製RNA活性(xìng)的(dí)同時(shí)能使組織(zhī)變(biàn)成(chéng)單(dān)個細胞，降解問題也就(jiù)可以徹(chè)di解(jiě)決了。

液(yè)氮(dàn)碾(niǎn)磨就是(shì)zui有(yǒu)效(xiào)的這樣一種辦法。但(dàn)是，液氮碾磨(mó)方(fāng)法非(fēi)常麻(má)煩(fán)，如(rú)果(guǒ)碰(pèng)到(dào)樣品數比(bǐ)較(jiào)多(duō)的(dí)時候(hòu)更加會有此感覺(jué)。這(zhè)樣就(jiù)產生了(liǎo)退(tuì)而求其次的方法：匀(yún)漿器(qì)。匀(yún)漿(jiāng)器方(fāng)法沒有考(kǎo)慮(lǜ)細(xì)胞(bāo)與裂解液接(jiē)觸(chù)前(qián)如何抑製(zhì)Rnase活(huó)性這(zhè)個問(wèn)題，而(ér)是祈禱破(pò)碎(suì)組織(zhī)的(dí)速度(dù)比細(xì)胞內的Rnase降(jiàng)解(jiě)RN 的(dí)速度(dù)快(kuài)

電動(dòng)匀漿器效(xiào)果(guǒ)較好(hǎo)，玻璃匀漿(jiāng)器效(xiào)果較(jiào)差，但總(zǒng)的來(lái)說，匀(yún)漿器(qì)方法是不能(néng)杜絕(jué)降(jiàng)解(jiě)現(xiàn)象的。因此，如果(guǒ)抽(chōu)提出(chū)現降解，原來(lái)用(yòng)電(diàn)動(dòng)匀漿器的(dí)，改用(yòng)液(yè)氮碾磨；原來用(yòng)玻璃匀漿器的(dí)，改用電動(dòng)匀(yún)漿器(qì)或(huò)者直接(jiē)用液氮碾磨，問題(tí)幾(jī)乎(hū) 100% 能獲得解(jiě)決(jué)。

三，樣(yàng)品的收集(jí)/保存(cún)

影(yǐng)響降解(jiě)的因素樣(yàng)品離開(kāi)活體(tǐ)/或者(zhě)原(yuán)來的生長環(huán)境後，樣(yàng)品(pǐn)中(zhōng)的(dí)內源(yuán)酶即會開(kāi)始(shǐ)降(jiàng)解(jiě) RNA，降(jiàng)解速(sù)度與內源酶含(hán)量及溫度有關(guān)。傳(chuán)統(tǒng)上(shàng)，隻有(yǒu)兩個(gè)辦法可(kě)以(yǐ)徹di抑製(zhì)內源酶(méi)活(huó)性：立即加入裂(liè)解液並且徹di而迅速地(dì)匀漿；切成(chéng)小塊(kuài)後(hòu)立即投(tóu)入(rù)液(yè)氮冷凍(dòng)。這兩(liǎng)個辦(bàn)法都要(yào)求操(cāo)作(zuò)快速(sù)。後者適(shì)合所有(yǒu)的樣(yàng)品(pǐn)，而(ér)前者隻(zhī)適合細胞及內源(yuán)酶含量較低(dī)的(dí)並且較容易(yì)匀漿(jiāng)的組織(zhī)。具體(tǐ)地(dì)講，植(zhí)物組(zǔ)織(zhī)，肝(gān)髒，胸(xiōng)腺，胰腺，脾(pí)髒，腦(nǎo)，脂肪，肌肉組(zǔ)織(zhī)等(děng)最好(hǎo)都(dū)先(xiān)用(yòng)液氮(dàn)冷凍起來(lái)，再往下做。

四，裂(liè)解液的選(xuǎn)擇(zé)

影(yǐng)響操作方(fāng)便程度，內源(yuán)雜(zá)質殘留(liú)的因(yīn)素(sù)常用的裂(liè)解液幾(jī)乎(hū)都能抑(yì)製(zhì)Rnase活性(xìng)，因(yīn)此，選擇(zé)裂解液的重點是要結(jié)合純化(huà)方法一起(qǐ)考慮。隻(zhī)有一個(gè)例外：高(gāo)內(nèi)源(yuán)酶含量的樣品(pǐn)建議(yì)使用含苯(běn)酚的(dí)裂(liè)解液，以增加滅活(huó)內(nèi)源酶(méi)的能力。

五，純(chún)化(huà)方法的(dí)選擇(zé)

影響內源雜質殘留，抽(chōu)提(tí)速(sù)度的因(yīn)素對於(yú)幹淨(jìng)的(dí)樣品，如(rú)細(xì)胞，手邊的幾(jī)乎任(rèn)何純化(huà)方(fāng)法都可以獲得滿(mǎn)意(yì)的結(jié)果。但(dàn)對(duì)於許多其它(tā)樣品(pǐn)，尤其是植物，肝髒，細菌(jūn)等雜質含(hán)量(liáng)很高(gāo)的樣品，選擇(zé)合適(shì)的純化方法是至(zhì)關重要(yào)的。柱(zhù)離心(xīn)式(shì)純(chún)化方法抽提速(sù)度快，能(néng)有效去除影(yǐng)響(xiǎng)RNA後(hòu)續酶(méi)反應(yīng)的雜質，但價(jià)格(gé)較(jiào)貴(guì)；使用經濟而經(jīng)典(diǎn)的(dí)純化方(fāng)法(fǎ)，如LiCl沉澱等，也可(kě)以獲(huò)得滿意(yì)的結果(guǒ)，但操(cāo)作(zuò)時(shí)間長。

六，RNase汙(wū)染(rǎn)的來(lái)源(yuán)

1. 手(shǒu)指，手指頭(tóu)是(shì)外源酶的第一(yī)來(lái)源，所以必(bì)需(xū)戴(dài)手(shǒu)套並(bìng)且(qiě)頻繁更換。另外，口(kǒu)罩也必需戴，因(yīn)為呼(hū)吸也(yě)是一個(gè)重(zhòng)要(yào)的(dí)酶來(lái)源。戴(dài)手套口罩的(dí)另外(wài)的好(hǎo)處(chǔ)是保護實(shí)驗(yàn)人員。

2. 槍頭，離(lí)心管，移液(yè)器 – 單(dān)純(chún)的滅(miè)菌是不能滅活Rnase的，所以(yǐ)槍(qiāng)頭(tóu)和離(lí)心(xīn)管(guǎn)要用DEPC處(chǔ)理(lǐ)，即(jí)使(shǐ)是(shì)標明為(wéi)DEPC處理過的。移(yí)液(yè)器(qì)最(zuì)好(hǎo)是專(zhuān)用的(dí)，用(yòng)前(qián)用75%的酒精棉球搽(chá)拭(shì)幹(gān)淨，尤其(qí)是杆子；另外，一(yī)定不(bù)要(yào)使用褪(tuì)頭器。

3. 水(shuǐ)/緩衝液一(yī)定(dìng)要(yào)確保無Rnase汙(wū)染(rǎn)。

4. 實(shí)驗台麵最起碼要用75%的(dí)酒(jiǔ)精棉(mián)球(qiú)搽拭幹(gān)淨。

5. 內源Rnase所有組織(zhī)均含內(nèi)源酶，故(gù)組織(zhī)用液氮(dàn)速凍是降(jiàng)低降(jiàng)解(jiě)的最好辦(bàn)法。液氮保(bǎo)存(cún)/碾磨(mó)方法的(dí)確不(bù)方便，但對(duì)有一些內源酶含(hán)量很(hěn)高(gāo)的組織，卻(què)是唯yi的(dí)辦法。

6. RNA樣品RNA抽提產(chǎn)物可(kě)能(néng)都(dū)會含痕(hén)量的Rnase汙染。

7. 質粒抽提(tí)質(zhì)粒抽提往(wǎng)往用到Rnase降(jiàng)解RNA，殘(cán)留的Rnase要用(yòng) Proteinase K消(xiāo)化，PCI 抽(chōu)提。

8. RNA保(bǎo)存(cún)即(jí)使低溫保(bǎo)存，痕量的(dí)Rnase亦(yì)會(huì)導致RNA降解。長(cháng)期保(bǎo)存(cún)RNA 的最好(hǎo)辦法是(shì)鹽(yán)/醇懸液，因(yīn)為(wéi)醇在(zài)低溫時抑製(zhì)所(suǒ)有(yǒu)的酶(méi)活(huó)性。

9. 陽(yáng)離子（Ca，Mg）在含這些(xiē)離(lí)子(zǐ)時，80C加熱(rè)5分鐘(zhōng)會(huì)導(dǎo)致(zhì)RNA被剪切，故(gù)如果(guǒ)RNA需要被(bèi)加(jiā)熱(rè)，保存(cún)液(yè)需(xū)要含(hán)螯合(hé)劑(jì)（1mM Sodium Citrate， pH 6.4）。

10. 後(hòu)續(xù)實(shí)驗所用的酶酶均(jūn)有(yǒu)可能(néng)被Rnase汙(wū)染。

更(gēng)多有(yǒu)關RNA提(tí)取(qǔ)準備工(gōng)作(zuò)及(jí)注(zhù)意(yì)事(shì)項(xiàng)，請聯係天津益(yì)元(yuán)利康生物科技有限(xiàn)公(gōng)司。