免(miǎn)疫共(gòng)沉(chén)澱(diàn)（CO-IP）是以抗(kàng)體和(hé)抗(kàng)原(yuán)之間(jiān)的專(zhuān)一性作用為(wéi)基(jī)礎(chǔ)的(dí)用(yòng)於(yú)研究蛋白(bái)質相互作(zuò)用的經(jīng)典方(fāng)法。那麼(mó)你知道免(miǎn)疫共(gòng)沉(chén)澱實驗操作(zuò)有哪些嗎(má)
？讓我們一起(qǐ)來看(kàn)看(kàn)吧！

一
，蛋白樣品製備

裂解提取(qǔ)出免(miǎn)疫沉(chén)澱需要的蛋白樣(yàng)品(pǐn)，以下(xià)為HEK293T細胞樣(yàng)品(pǐn)的處(chǔ)理方法(fǎ)，其餘(yú)的(dí)樣品製備(bèi)方(fāng)法(fǎ)參(cān)閱相(xiāng)關文(wén)獻(xiàn)。

單(dān)層貼壁細胞總蛋(dàn)白(bái)的(dí)提(tí)取：

1. 收集細(xì)胞(bāo)：10cm細(xì)胞(bāo)培養板上，每板細(xì)胞加(jiā)1ml ，4℃預冷的(dí)PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。反復衝(chōng)洗把(bǎ)所(suǒ)有掛壁細胞洗下來轉(zhuǎn)移(yí)到(dào)1.5ml離(lí)心(xīn)管(guǎn)內 離心：3400 rpm 2min。

2. 清洗(xǐ)細(xì)胞：棄上(shàng)清，（大(dà)槍(qiāng)頭套小槍(qiāng)頭）避免吸(xī)到(dào)沉(chén)澱(diàn)。再加(jiā)1mPBS，垂(chuí)懸吹打；離心：rpm3400 2min。棄(qì)上(shàng)清，將PBS吸(xī)淨後-80℃保(bǎo)存(cún)。

3. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍(biàn)珠(zhū)子(zǐ)，然(rán)後用PBS配製(zhì)成50%濃度，建(jiàn)議減(jiǎn)掉槍尖部(bù)分，避(bì)免在涉(shè)及瓊脂(zhī)糖(táng)珠的(dí)操作(zuò)中破壞(huài)瓊脂(zhī)糖珠。

4. 裂解蛋白(bái)，收集的(dí)細胞(bāo)中(zhōng)加入(rù)1000ul細(xì)胞裂(liè)解(jiě)液10ul蛋白(bái)酶(méi)抑製(zhì)劑(jì)，冰上靜置30min，每(měi)10min震(zhèn)蕩混匀(yún)一(yī)次，4℃，12000rpm離心(xīn)10min，收(shōu)集上(shàng)清液。

5. 每(měi)1 ml 總(zǒng)蛋(dàn)白(bái)中(zhōng)加入(rù)100 μl Protein A瓊脂糖(táng)珠（50%），4℃搖晃(huǎng)1 h以(yǐ)去除(chú)非特異性(xìng)雜(zá)蛋白，降低背(bèi)景。

6. 4℃，14000g離(lí)心15min，將上(shàng)清轉(zhuǎn)移到一個新(xīn)的離心管中標號Input，留Protein A珠子(zǐ)，標(biāo)號IP。

7. 變性(xìng)以及(jí)還原(yuán)蛋白

室溫溶解蛋白(bái)上(shàng)樣(yàng)緩衝液(yè)（5×），按照(zhào)4 uL蛋白樣品+1 ul (5×)的(dí)比例混(hùn)合，IP組(zǔ)加入50ul蛋白上(shàng)樣緩衝(chōng)液(yè)，在(zài)蛋白(bái)樣(yàng)品中(zhōng)加(jiā)入(rù)含SDS（保(bǎo)證(zhèng)樣品中的所(suǒ)有(yǒu)蛋(dàn)白(bái)帶電荷一(yī)致）的(dí)上(shàng)樣緩(huǎn)衝液，100℃加熱(rè)煮沸(fèi)，以充(chōng)分變(biàn)性蛋白(bái)。冰上驟冷，上樣到SDS-PAGE膠加(jiā)樣孔即可(kě)。

二
，經(jīng)過SDS-PAGE分離(lí)樣品(pǐn)

膠的選擇與製(zhì)備（根據目(mù)的蛋白(bái)的大小，選(xuǎn)擇合適(shì)的(dí)分(fēn)離(lí)膠的(dí)濃(nóng)度(dù)）

1. 凝(níng)膠(jiāo)的製備(bèi):根據(jù)目(mù)的(dí)蛋(dàn)白的大小來選(xuǎn)擇合適濃(nóng)度(dù)的分離膠。目的蛋白小(xiǎo)於(yú)20 k Da選(xuǎn)擇12%~15%的分離膠;大(dà)於(yú)20 k Da選(xuǎn)擇(zé)10%的(dí)分離(lí)膠(jiāo), 濃(nóng)縮膠(jiāo)一(yī)般固(gù)定為(wéi)5%。

2. 上(shàng)樣加入蛋白(bái)樣品，每孔加上樣液(yè)20ug，留一孔加(jiā)預(yù)染的marker。

3. 加滿電泳(yǒng)緩衝液(yè)，蓋上(shàng)槽(cáo)蓋(gài)，接通(tōng)電源(yuán)，先(xiān)用(yòng)70V恒壓電(diàn)泳，約(yuē)30min,當(dāng)指示(shì)劑溴(xiù)酚藍(lán)進(jìn)入分(fēn)離膠(jiāo)後改(gǎi)用90V恒壓電泳，當(dāng)指(zhǐ)示劑到達(dá)距凝(níng)膠下(xià)端(duān)約0.5cm處時關閉電(diàn)源，取(qǔ)出膠(jiāo)板。

三
，轉膜
，封(fēng)閉
，一抗
，二(èr)抗(kàng)孵(fū)育

將蛋(dàn)白凝膠中的(dí)蛋白，通(tōng)過電流作(zuò)用轉移到(dào)轉印膜(mó)上(shàng)。

1. 將(jiāng)剪(jiǎn)好的PVDF膜用(yòng)無水(shuǐ)甲醇潤濕30秒以(yǐ)上，然後(hòu)用dd H2O漂(piāo)洗(xǐ)2min,浸泡於轉移(yí)緩(huǎn)衝液(yè)中5min後(hòu)開(kāi)始後續操作(zuò)。

2. 裝(zhuāng)配(pèi)轉(zhuǎn)膜三(sān)明治結(jié)構（在轉移緩衝液(yè)中製備三明治可以(yǐ)避免(miǎn)氣泡(pào)的產生(shēng)）

黑(hēi)麵（負極）→海(hǎi)綿(mián)墊→3層濾紙(zhǐ)→凝膠(jiāo)→轉印(yìn)膜→3層濾紙→海綿(mián)墊→紅麵(miàn)（正(zhèng)極），每(měi)層(céng)之間不能(néng)有氣(qì)泡。然後(hòu)將三(sān)明治轉(zhuǎn)移(yí)至電泳槽中，黑(hēi)麵對黑麵。

3. 加入轉(zhuǎn)膜緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)，將(jiāng)電(diàn)轉儀(yí)置於冰(bīng)水(shuǐ)中，300mA恒(héng)流(liú)轉膜60-90min。

4. 轉膜結(jié)束後，使用(yòng)5% 脫(tuō)脂(zhī)奶(nǎi)粉室溫(wēn)封(fēng)閉(bì)1h。

5. 選擇合(hé)適(shì)的(dí)一抗孵育(yù)，室溫搖動(dòng)1h。

6. 孵育(yù)二(èr)抗，4℃孵育(yù)2h或(huò)室(shì)溫（22-25℃）搖(yáo)動孵(fū)育(yù)1h。（抗(kàng)體查(chá)相應(yīng)說明(míng)書確定(dìng)稀(xī)釋(shì)倍(bèi)數(shù)）

四
，顯影

1. 配置稀(xī)釋液，將(jiāng)A液和B液(yè)按(àn)照(zhào)（1：1）混(hùn)合。

2. 從TBST緩(huǎn)衝(chōng)液中取出(chū)膜，去(qù)除(chú)膜(mó)上的多(duō)餘緩(huǎn)衝液，但不要(yào)讓膜(mó)幹燥(zào)。

3. 將有蛋白的(dí)一麵朝上平(píng)整(zhěng)的鋪在一(yī)張紙(zhǐ)板上(shàng)，加上(shàng)配好(hǎo)的(dí)工作(zuò)稀(xī)釋液(yè)。用(yòng)量以覆(fù)蓋(gài)住膜(mó)為(wéi)基(jī)準。

4. 將(jiāng)膜與(yǔ)工作稀釋液孵育1-5min,確保整個表麵(miàn)覆蓋。

5. 去(qù)除多餘的(dí)液體，用保鮮膜(mó)包(bāo)好(hǎo)PVDF膜，暗室中(zhōng)X膠片(piàn)感(gǎn)光(guāng)顯影(yǐng)定影。

更多(duō)有(yǒu)關(guān)免疫共(gòng)沉澱的(dí)實驗操作，請(qǐng)聯係天(tiān)津益(yì)元(yuán)利康(kāng)生物科(kē)技有限公司。