細菌質粒是(shì)DNA重組技(jì)術(shù)中常用的(dí)載(zǎi)體。通過(guò)基(jī)因(yīn)工程(chéng)手(shǒu)段將需要的(dí)外源基因送進(jìn)受體(tǐ)細胞中(zhōng)去進(jìn)行(háng)增殖(zhí)和(hé)表(biǎo)達。將某(mǒu)種目標基(jī)因片段(duàn)重組到質粒中，構成(chéng)重組(zǔ)基因或(huò)重(zhòng)組(zǔ)體。然後將(jiāng)這種重組體經微(wēi)生物學的轉化(huà)技(jì)術，轉入受體細(xì)胞(bāo)(如大腸杆菌(jūn))中(zhōng)，使(shǐ)重組體中的(dí)目標基因(yīn)在受體菌中(zhōng)得以繁殖(zhí)或表達(dá)，從而改(gǎi)變(biàn)寄(jì)主(zhǔ)細胞(bāo)原有的性(xìng)狀(zhuàng)或(huò)產生新(xīn)的物(wù)質(zhì)。那(nà)麼你知道質粒(lì)構(gòu)建的方法有哪(nǎ)些嗎(má)？讓我們一起(qǐ)來(lái)看(kàn)看吧！

一，酶切(qiē)連(lián)接

傳統(tǒng)意(yì)義上，質粒重(zhòng)組是(shì)基於鹼(jiǎn)基互(hù)補配對(duì)的(dí)原理，一(yī)般(bān)做法(fǎ)為(wéi)：

1）通(tōng)過(guò)引(yǐn)物在(zài)目的(dí)片(piàn)段兩(liǎng)端引入酶切位點(diǎn)；

2）用(yòng)相同的(dí)限(xiàn)製性(xìng)內切酶分(fēn)別對目(mù)的(dí)片段和載(zǎi)體進行酶(méi)切(qiē)處理；

3）目的(dí)片段(duàn)和載體(tǐ)的(dí)酶切產(chǎn)物在體外連(lián)接；

4）連(lián)接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(huà)大腸杆菌(jūn)；

5）篩(shāi)選重(zhòng)組子。

在實(shí)驗中，我(wǒ)們的(dí)每一步都需(xū)要(yào)根(gēn)據該(gāi)目的基(jī)因(yīn)與載體的(dí)特性調整實驗(yàn)；考慮到(dào)後續實(shí)驗(yàn)，在(zài)選擇(zé)載體時務(wù)必(bì)要(yào)滿足(zú)與宿主(zhǔ)細胞兼容且容(róng)易檢(jiǎn)出的條件(jiàn)；

二(èr)，Gateway技術

    高(gāo)通量(liáng)基因克隆技術(shù)（Gateway Cloning Technology），是(shì)由Invitrogen公司(sī)在二(èr)十(shí)世紀九十年代末發(fā)明(míng)並(bìng)應(yīng)用於分子(zǐ)生物學基因(yīn)克(kè)隆(lóng)的一(yī)項zhuan利(lì)技(jì)術。它(tā)利用專(zhuān)有(yǒu)的重組(zǔ)序(xù)列(liè)使(shǐ)得(dé)DNA片(piàn)段(duàn)能(néng)夠(gòu)更有(yǒu)效地(dì)被轉入質粒當(dāng)中，可應(yīng)用(yòng)於大片段(duàn)的基因克(kè)隆，並且在(zài)保持正確(què)閱(yuè)讀框(kuàng)的前提下讓(ràng)不(bù)同(tóng)表(biǎo)達載體(tǐ)間(jiān)的DNA轉移成為(wéi)可能。

    這一技術在插(chā)入的目的(dí)DNA片(piàn)段(duàn)兩端整(zhěng)合att L1和att L2兩(liǎng)個側端重(zhòng)組(zǔ)序(xù)列（Flanking Recombination Sequence），來構建一(yī)個(gè)類似通道的結構並稱之為“入(rù)門克隆(lóng)"（Gateway Entry Clone），可以(yǐ)避(bì)免目的片段內存在(zài)切點(diǎn)的問題(tí)而(ér)使(shǐ)得大(dà)片(piàn)段DNA保(bǎo)持(chí)其(qí)完整(zhěng)性(xìng)，大大提高(gāo)了克(kè)隆效率，常(cháng)應用於大(dà)規模的DNA片(piàn)段(duàn)整(zhěng)合(hé)進同(tóng)一(yī)種表(biǎo)達載(zǎi)體(tǐ)，因此(cǐ)稱(chēng)之(zhī)為高(gāo)通(tōng)量基(jī)因克(kè)隆技術(shù)。

三(sān)，LIC技術

    Ligation-Independent cloning，簡稱LIC。采用LIC方法(fǎ)的pET載(zǎi)體是(shì)綫(xiàn)性化(huà)的(dí)，在(zài)末(mò)端有12-15個突出的鹼基以在(zài)退火時和(hé)目(mù)的(dí)片斷(duàn)互補。在設計PCR擴(kuò)增(zēng)引物時加(jiā)入與LIC載體(tǐ)互補的序列，PCR產(chǎn)物(wù)用(yòng)3’→5’的內(nèi)切酶消化出單(dān)鏈(liàn)與載體互(hù)補的序列(liè)。通過這(zhè)種方式(shì)就可以把(bǎ)目的(dí)片斷定(dìng)向，高效(xiào)地插(chā)入(rù)LIC載體上。一般的(dí)pET載體是(shì)先在不(bù)含DE3片(piàn)段的菌株中進行克隆篩(shāi)選，之後再把(bǎ)陽性(xìng)克隆轉(zhuǎn)化(huà)進(jìn)入表(biǎo)達(dá)菌(jūn)株，如(rú)BL21（DE3）中(zhōng)，通過IPTG誘導進行(háng)表達(dá)。

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