質粒構(gòu)建(jiàn)是(shì)分子生(shēng)物學研究(jiū)中zui常用的實(shí)驗技術，原(yuán)理依賴於限製(zhì)性(xìng)核酸內(nèi)切(qiē)酶(méi)，DNA連接酶和其他修飾(shì)酶的作(zuò)用，分別(bié)對目的基因(yīn)和載(zǎi)體(tǐ)DNA進行適當(dāng)切割(gē)和(hé)修飾(shì)後(hòu)，將二(èr)者連(lián)接在一起(qǐ)，再(zài)導入宿主(zhǔ)細胞，實現(xiàn)目(mù)的基因在宿主細(xì)胞(bāo)內(nèi)的(dí)正確表(biǎo)達。那麼(mó)你知(zhī)道質粒構建的過(guò)程(chéng)有(yǒu)哪些(xiē)嗎(má)？讓(ràng)我們一起來(lái)看(kàn)看(kàn)吧(bā)！

一，質粒載體製(zhì)備(bèi)

    質(zhì)粒載體(tǐ)的(dí)製(zhì)備既可以選擇(zé)單(dān)酶切也可(kě)以(yǐ)選(xuǎn)擇雙酶(méi)切，一(yī)般(bān)推(tuī)薦使用雙酶(méi)切。其實目的就隻有一個(gè)，盡(jìn)量(liáng)使載體(tǐ)的(dí)末端(duān)具(jù)有特異性，防(fáng)止自連。

1）選(xuǎn)擇質粒上兩個(gè)酶(méi)切位點的距離不(bù)應小於(yú)太小(xiǎo)（>10bp），否則影(yǐng)響限(xiàn)製性(xìng)內切酶(méi)對(duì)切點的(dí)識別(bié)，不利(lì)於空(kōng)載體的雙酶切。

2）一(yī)般目(mù)的基(jī)因(yīn)用於(yú)克隆(lóng)表達的情(qíng)況下(xià)，酶(méi)切位(wèi)點的選擇(zé)要考慮到(dào)
：目(mù)的基因(yīn)片段(duàn)內(nèi)部(bù)不(bù)含(hán)有所選的酶切(qiē)位點(diǎn)（不然鑒(jiàn)定(dìng)陽性(xìng)重(zhòng)組(zǔ)子雙酶切時會將目的基(jī)因(yīn)切斷(duàn)）。

3）實(shí)驗後繼(jì)應(yīng)用的所(suǒ)有(yǒu)載(zǎi)體(tǐ)（真核(hé)，原(yuán)核，酵(jiào)母，昆(kūn)蟲(chóng)）都(dū)盡(jìn)可能含有(yǒu)所(suǒ)選的酶切(qiē)位(wèi)點(diǎn)。並且(qiě)要保證在載體上(shàng)的插入(rù)方向(xiàng)正(zhèng)確（定(dìng)向(xiàng)克隆(lóng)）。（不然(rán)換載體表達時(shí)，還(huán)要重新(xīn)設(shè)計引物，以引(yǐn)進(jìn)新(xīn)的酶切(qiē)位點(diǎn)）。

4）盡可能選(xuǎn)比(bǐ)較常(cháng)用(yòng)的酶(méi)切位點（常用(yòng)切點酶的價(jià)格比(bǐ)較便(biàn)宜）。

5）兩個酶(méi)切點至少隔上3個(gè)鹼基(jī)。

6）兩個(gè)酶(méi)切點最(zuì)好(hǎo)不要是同(tóng)尾酶（切下來(lái)的殘(cán)基不要(yào)互補(bǔ)），否則效(xiào)果相當(dāng)於單酶切(qiē)。

7）最好使用(yòng)酶切效率(shuài)高的(dí)酶(méi)。

8）最好使(shǐ)用雙酶切(qiē)有(yǒu)共同buffer的(dí)酶(méi)。

二，目的片段製備

    主要使(shǐ)用PCR擴(kuò)增(zēng)的(dí)手(shǒu)段，首先要對(duì)目標(biāo)片段進行擴(kuò)增富集。PCR 即聚合酶(méi)鏈(liàn)式反(fǎn)應，它是一種用於擴增復製特(tè)定(dìng) DNA 片(piàn)段的(dí)常(cháng)用分子(zǐ)生(shēng)物(wù)學(xué)技術。PCR 的(dí)最大(dà)特點是(shì)能將微(wēi)量(liáng)的 DNA 大(dà)幅擴增(zēng)，在克隆(lóng)前獲(huò)得(dé)大量的目標(biāo)基(jī)因(yīn)片段。

    利用(yòng)引(yǐn)物設(shè)計軟(ruǎn)件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在綫(xiàn)設(shè)計引物(wù)並合成(chéng)後(hòu)，配製(zhì) PCR 反(fǎn)應體(tǐ)係
：將模板，引(yǐn)物，dNTP，酶(méi)，反應緩(huǎn)衝液(yè)和 ddH₂O 按比例加入，加(jiā)好(hǎo)後輕微(wēi)點離，放入 PCR 儀中(zhōng)擴增(zēng)目的(dí)片(piàn)段，擴增(zēng)後通過瓊脂糖凝膠(jiāo)檢(jiǎn)測(cè)目的片段(duàn)大(dà)小(xiǎo)是(shì)否正確(què)。

三(sān)，酶(méi)切連接(jiē)

    獲(huò)得目標(biāo)片(piàn)段(duàn)後(hòu)，要與(yǔ)我們的(dí)質粒(lì)載體進行連接，必須借助(zhù)兩個(gè)工(gōng)具來實現——酶切工具（限製性(xìng)內(nèi)切(qiē)酶(méi)）和(hé)連(lián)接(jiē)工具(jù)（DNA 連接酶(méi)），這裏(lǐ)使(shǐ)用(yòng)的內切(qiē)酶(méi)在(zài)我們的(dí)片段和載體上(shàng)產(chǎn)生(shēng)的接口(kǒu)一定要(yào)相(xiāng)同(tóng)，不(bù)然(rán)DNA連接酶是無(wú)法(fǎ)將它們連(lián)接上的。

四，轉化(huà)鑒定

    將連(lián)接(jiē)產物加(jiā)入感(gǎn)受態細胞（常(cháng)見的感(gǎn)受(shòu)態細胞
：DH5α，BL21，他們可(kě)是轉運(yùn)過程的小能手，負責(zé)質粒(lì)的(dí)克(kè)隆和表達，這(zhè)裏(lǐ)下期(qī)科(kē)普百科(kē)會詳(xiáng)細介紹(shào)），冰上(shàng)放置(zhì)30min，42°C 熱激轉(zhuǎn)化(huà)或(huò)電轉(zhuǎn)化(huà)，加(jiā)入無抗(kàng)性(xìng) LB 培養基(jī)，200rpm -37°C 搖(yáo)床(chuáng)搖 45-60min 後，塗(tú)至抗(kàng)性或(huò)者其他(tā)篩選平板上(shàng)，37°C 培養(yǎng)過夜(yè)，挑取(qǔ) 3-5 單(dān)個克隆搖(yáo)菌，菌落 PCR 或提取(qǔ)質(zhì)粒後酶(méi)切鑒定(dìng)，鑒定完(wán)畢後送質粒(lì)或菌(jūn)液(yè)測(cè)序驗證。

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