TUNEL檢測是一種(zhǒng)用於檢測細(xì)胞(bāo)凋亡（程序(xù)性(xìng)細(xì)胞死(sǐ)亡）的方(fāng)法(fǎ)。細胞(bāo)凋(diāo)亡是一(yī)種(zhǒng)重要的細(xì)胞(bāo)生物學(xué)過(guò)程，它在多(duō)種生理和(hé)病理情況下發(fā)揮(huī)作用(yòng)，包(bāo)括(kuò)發育，組織修復和免疫應答(dá)等(děng)。那麼你(nǐ)知道(dào)Tunel檢測(cè)的實驗(yàn)步(bù)驟與注意(yì)事項嗎(má)？讓我(wǒ)們一起來看看(kàn)吧！

一(yī)，Tunel檢測的(dí)操作(zuò)步(bù)驟

1. 脫蠟(là)和(hé)組織(zhī)復性

將組織(zhī)在(zài)二(èr)甲苯中浸(jìn)泡兩次(cì)，每次(cì)10-20分鐘(zhōng)。在(zài)100%乙醇中洗(xǐ)滌(dí)兩次，每次5分鐘。然後(hòu)依(yī)次(cì)在(zài)95%，70%和50%乙醇中洗(xǐ)滌3分(fēn)鐘。

2. PBS洗(xǐ)滌和蛋(dàn)白(bái)酶處(chǔ)理

用200-500 µL PBS洗滌(dí)樣品(pǐn)兩次，每(měi)次(cì)5分(fēn)鐘。排除(chú)組織中多餘的PBS，並在20 µg/mL蛋白酶K溶液(yè)中(zhōng)孵育15分鐘。

3. TdT標(biāo)記反應緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)/反應(yīng)混合物孵育

配製(zhì)TdT標(biāo)記(jì)反應緩衝液(yè)。向每(měi)個(gè)樣品中加(jiā)入(rù)50 µL反應混合物(wù)，並(bìng)在(zài)濕盒(hé)中(zhōng)避光(guāng)下37℃孵育(yù)2小(xiǎo)時(shí)。

4. PBS洗(xǐ)滌和(hé)DAPI復(fù)染(rǎn)

在(zài)PBS中將樣(yàng)品(pǐn)洗(xǐ)滌3次(cì)，每次5分鐘。通過在1×DAPI中孵育10分鐘(zhōng)對樣品進行復染。

5. 觀(guān)察和拍(pāi)照(zhào)

將樣品在(zài)PBS中洗滌3次(cì)，每次(cì)5分(fēn)鐘。然(rán)後(hòu)加入(rù)水性封固劑或防(fáng)淬(cuì)滅溶液(yè)，封住蓋玻片(piàn)。最(zuì)後使(shǐ)用熒光(guāng)顯(xiǎn)微(wēi)鏡觀察(chá)，並進(jìn)行(háng)熒(yíng)光顯微鏡拍(pāi)照(zhào)觀(guān)察，紅(hóng)色(sè)通(tōng)道（Ex/Em=555 nm/565 nm）。

二，注意事(shì)項

1. 設立陽性和(hé)陰性細胞對照(zhào)：

陽(yáng)性組：用(yòng)DNase酶處(chǔ)理，誘(yòu)導細(xì)胞(bāo)凋亡，使(shǐ)3'-OH末端(duān)暴(bào)露(lòu)。每(měi)次(cì)實(shí)驗隻需做一(yī)個陽性組(zǔ)。

陰性組：不(bù)加TdT酶，其餘(yú)操作和實驗(yàn)組相同。

實驗組：除了陽性(xìng)組(zǔ)和(hé)陰性組，所有樣(yàng)本均(jūn)屬於實驗組(zǔ)。

2. 選(xuǎn)擇固定(dìng)液：

建(jiàn)議使用4%多聚甲醛（PBS）進行(háng)固定。不建(jiàn)議使用(yòng)乙(yǐ)醇(chún)和(hé)甲醇(chún)作(zuò)為固定液。不(bù)要選用含有(yǒu)甲醇(chún)的(dí)甲醛替代品(pǐn)，因(yīn)為這會降低標記效(xiào)率，使熒(yíng)光觀察困難。

3. 貼壁細胞處理：

貼(tiē)壁細(xì)胞(bāo)在加藥(yào)誘導(dǎo)凋亡(wáng)後(hòu)，細胞(bāo)狀(zhuàng)態(tài)會(huì)發生改變，形態會皺縮邊(biān)緣，貼壁粘附(fù)力降低。在對這(zhè)些細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗染色(sè)時(shí)，需(xū)要小心(xīn)操作，避免吹打造成(chéng)細(xì)胞脫落。特別是在(zài)多(duō)次洗(xǐ)滌細胞(bāo)時，操作(zuò)要(yào)小(xiǎo)心輕柔。

4. 避光(guāng)操(cāo)作(zuò)和(hé)孵(fū)育：

熒光基團長(cháng)期(qī)暴露(lòu)在普(pǔ)通(tōng)光照下，會(huì)發(fā)生(shēng)嚴重淬(cuì)滅。

在(zài)實(shí)驗(yàn)操(cāo)作中(zhōng)應盡量(liáng)避光操作和(hé)孵育(yù)，以保(bǎo)證(zhèng)熒光觀察效(xiào)果。

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