NEBNext®Q5熱啟動高保真PCR Master Mix是(shì)Q5高保(bǎo)真(zhēn)DNA聚(jù)合酶的(dí)原始熱啟動NEBNext配方
。該製劑也作為(wéi)成分包含在所有用(yòng)於DNA和RNA文(wén)庫製(zhì)備(bèi)的(dí)原始(shǐ)NEBNext Ultra試(shì)劑(jì)盒(hé)中
。

預混液(yè)中均(jūn)有(yǒu) Q5 超(chāo)保真(zhēn) DNA 聚(jù)合(hé)酶，它是一種具備(bèi)熱(rè)穩(wěn)定性(xìng)的新型 DNA 聚(jù)合(hé)酶(méi)，具(jù)有 3´→5´ 核(hé)酸外切(qiē)酶活性(xìng)，並且融(róng)合了(liǎo)具有(yǒu)增(zēng)強(qiáng)持(chí)續(xù)合成能力的 Sso7d 結構域(yù)
。Q5 還具有優異的保(bǎo)真度(dù)（比 Taq DNA 聚合酶(méi)高(gāo) 280 倍(bèi)），錯配率(shuài)極低(dī)
。

這(zhè)款便捷的(dí) 2X 預混液包含 dNTP，Mg++ 以及專有(yǒu)緩衝(chōng)液(yè)，僅需(xū)加(jiā)入引物和 DNA 模板(bǎn)，即可(kě)穩(wěn)健擴增
。加入熱啟動(dòng)適配(pèi)體(tǐ)後(hòu)，可(kě)以(yǐ)更方便地在室(shì)溫下建(jiàn)立反應體係(xì)
。

操作使用：

1. 使(shǐ)用(yòng)高(gāo)質量(liáng)，純化的DNA模板(bǎn)可大大提(tí)高(gāo)PCR反應(yīng)的(dí)成(chéng)功率
。50μl反(fǎn)應的(dí)DNA模板(bǎn)推薦(jiàn)量如下(xià)：

2. Mg++和添(tiān)加劑(jì)：

NEBNext Q5 熱啟動 HiFi PCR 預混液(yè)在 1X 濃(nóng)度下(xià)使用時含有 2.0 mM Mg ++
。這對(duì)於使用該預(yù)混(hùn)液(yè)產生的大多數(shù)PCR產物是最jia選擇
。

3. 脫氧(yǎng)核(hé)苷(gān)酸(suān)：

dNTP的最(zuì)終(zhōng)濃度經過優(yōu)化，可(kě)實(shí)現穩健的文(wén)庫擴(kuò)增
。Q5 高保真(zhēn) DNA 聚(jù)合(hé)酶不能(néng)摻入 dUTP，不(bù)建議與含有(yǒu)尿(niào)嘧啶(dìng)的引(yǐn)物(wù)或(huò)模板一(yī)起使(shǐ)用
。

4. DNA聚(jù)合(hé)酶濃度：

NEBNext Q5 熱(rè)啟動(dòng) HiFi PCR 預混(hùn)液中(zhōng) DNA 聚合酶的濃度經過優(yōu)化，可(kě)在各(gè)種條件下獲得最佳結(jié)果(guǒ)
。

5. 變性(xìng)：

對於大多數樣(yàng)品(pǐn)類(lèi)型，在 98°C 下 30 秒(miǎo)的(dí)初始變性就(jiù)足夠了
。在熱循(xún)環(huán)過程中(zhōng)，變性(xìng)步驟應保(bǎo)持在(zài)zui低限度(dù)
。通常(cháng)，對於(yú)大多數(shù)模(mó)板，建議在 98°C 下(xià)變(biàn)性(xìng) 10 秒
。

6. 退火：

對於 NEBNext 索引(yǐn)引(yǐn)物以(yǐ)外的 NGS 引物，Tm 可能不同
。在(zài)這(zhè)種情(qíng)況下(xià)，在 Tm 下(xià)使(shǐ)用(yòng) 30 秒（使用 NEB Tm 計(jì)算器），在(zài) 65°C 下使(shǐ)用 45 秒
。

7. 外延：

推薦的(dí)延(yán)伸(shēn)溫度為 65°C
。 對於最大(dà) 1 kb 的(dí)庫，擴(kuò)展時(shí)間通常為 30 秒
。較大(dà)的(dí)刀(dāo)片(piàn)長度可能(néng)需(xū)要額外的時間
。建(jiàn)議在 65°C 下最後(hòu)一次延(yán)長 5 分鐘(zhōng)
。

8. PCR產物：

使(shǐ)用 NEBNext Q5 熱啟(qǐ)動 HiFi PCR 預混液生成的 PCR 產(chǎn)物具有鈍(dùn)端
。

9. 磁珠兼容性：

NEBNext Q5 熱啟(qǐ)動 HiFi PCR 預(yù)混液(yè)與多(duō)種羧(suō)基(jī)化(huà)，甲(jiǎ)苯(běn)磺(huáng)酰化和鏈(liàn)黴(méi)親和(hé)素(sù)微珠兼容，這(zhè)些(xiē)微(wēi)珠可繼(jì)承或包含(hán)在文(wén)庫構建(jiàn)方案(àn)的 PCR 步(bù)驟(zhòu)中，包括(kuò) Agencourt AMPure XP （Beckman Coulter， Inc.），Sera-Mag SpeedBeads 和 Mag-Bind RXNPure Plus （Omega Bio-tek， Inc.）
。建議使(shǐ)用SPRI微球或PCR純(chún)化柱進行PCR後(hòu)純化(huà)
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