NEB-Q5定點(diǎn)突變(biàn)試(shì)劑(jì)盒(hé)（不含感受(shòu)態(tài)細(xì)胞）可(kě)以在(zài) 2 小時(shí)內快速(sù)對雙(shuāng)鏈質粒(lì)DNA進(jìn)行(háng)定點(diǎn)突(tū)變
。該(gāi)試(shì)劑(jì)盒(hé)使用(yòng)穩定的(dí)Q5熱(rè)啟動(dòng)超保(bǎo)真 DNA 聚(jù)合酶(méi)，結合(hé)客戶自行(háng)設(shè)計的(dí)引物，在(zài)各(gè)種質粒中引入插入，缺(quē)失和替換(huàn)突變
。PCR 後將擴增材料(liào)直(zhí)接(jiē)添(tiān)加到du特(tè)的激(jī)酶-連接酶-DpnI（KLD）酶混合(hé)液中，進行快速室溫環化(huà)和模板(bǎn)去(qù)除(chú)（5 分鐘）
。操作方(fāng)便，簡(jiǎn)單(dān)，隻需(xū)一天(tiān)時間便可完成(chéng)整個操作(zuò)，並且不受(shòu)載體，宿(sù)主(zhǔ)菌(jūn)的(dí)限製
。

操(cāo)作使用
：

步驟 I
：指數擴(kuò)增 （PCR）

1. 將以(yǐ)下試(shì)劑(jì)組裝在(zài)薄壁PCR管中
。

2. 將(jiāng)試劑(jì)wan全混(hùn)合(hé)，然後轉(zhuǎn)移(yí)到熱循(xún)環儀中
。

3. 執(zhí)行(háng)以下循環條件
： 常規PCR的(dí)熱循環(huán)條件
：

* 有關(guān)誘(yòu)變(biàn)引(yǐn)物的 Q5 優(yōu)化退火溫度(dù)，請(qǐng)使(shǐ)用在(zài)綫 NEB 引物設計(jì)軟件 NEBaseChanger™
。對(duì)於(yú)預(yù)先設計的(dí)背(bèi)靠(kào)背(bèi)引(yǐn)物組，可(kě)以應用(yòng) Ta = Tm + 3 規則(zé)，但可能(néng)需要(yào)進行優(yōu)化
。

注意(yì)
：我(wǒ)們建議(yì)通過(guò)在瓊脂糖凝膠上(shàng)觀(guān)察 2–5 μl 反應(yīng)來確(què)保(bǎo) PCR 產物幹淨
。

第(dì)二步(bù)
：激(jī)酶(méi)，連接酶(méi)和DpnI（KLD）處理(lǐ)

1. 組裝以下試(shì)劑(jì)
：

2. 上(shàng)下移液充分(fēn)混(hùn)合，在(zài)室溫(wēn)下孵(fū)育 5 分(fēn)鐘
。

第(dì)三步(bù)
：轉(zhuǎn)型(xíng)

1.在冰(bīng)上(shàng)解凍50μl化(huà)學(xué)感(gǎn)受態大(dà)腸杆(gān)菌(jūn)細(xì)胞[NEB 5-α感(gǎn)受(shòu)態大(dà)腸杆(gān)菌(jūn)（高效），NEB #C2987]
。

2.將(jiāng)步(bù)驟(zhòu)II中(zhōng)的5μlKLD混合物加(jiā)入(rù)解(jiě)凍的(dí)細胞管(guǎn)中(zhōng)
。小心地(dì)輕彈管(guǎn)子 4-5 次以混合(hé)
。不(bù)要渦旋
。

3. 將混合物(wù)放在(zài)冰(bīng)上(shàng) 30 分(fēn)鐘
。

4.在(zài)42°C下熱休(xiū)克(kè)30秒
。

5. 放(fàng)在冰上 5 分鐘(zhōng)
。

6. 將(jiāng) 950 μl 室溫 SOC 移(yí)液(yè)到混(hùn)合(hé)物中(zhōng)
。

7. 在 37°C 下振蕩 （250 rpm） 孵(fū)育(yù) 60 分(fēn)鐘
。

8. 通(tōng)過(guò)輕彈試管(guǎn)和倒(dǎo)置(zhì)徹di混合(hé)細胞(bāo)，然後將(jiāng) 50-100 μl 鋪展到選擇(zé)板(bǎn)上，並(bìng)在 37°C 下孵(fū)育(yù)過夜
。 可(kě)能需要(yào)（特別是(shì)對於(yú)簡(jiǎn)單的替換和(hé)刪除(chú)實(shí)驗）在鋪板之前(qián)將 SOC 中的(dí)轉化混合物(wù)稀釋(shì) 10 到(dào) 40 倍，以避(bì)免菌落的(dí)草(cǎo)坪

產(chǎn)品選(xuǎn)購
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