Elabscience乳酸脫氫(qīng)酶(LDH)細胞毒(dú)性比色法測(cè)試(shì)盒(hé)(E-BC-K771-M)可用於以(yǐ)乳酸(suān)脫氫(qīng)酶(LDH)釋放為指(zhǐ)標的(dí)細(xì)胞毒(dú)性檢測。

檢測原理(lǐ)：

乳酸(suān)脫氫(qīng)酶(méi)催化乳酸(suān)和(hé) NAD+反(fǎn)應(yīng)產生(shēng)丙(bǐng)酮酸(suān)和 NADH
，NADH在(zài)PMS作用(yòng)下
，將電子(zǐ)傳遞(dì)給(gěi) WST-8
，產生黃(huáng)色的(dí)產物(wù)
，其在(zài)450 nm有(yǒu)特征(zhēng)吸收峰(fēng)
，從而(ér)可以通過(guò)比(bǐ)色法(fǎ)來(lái)定量乳酸(suān)脫(tuō)氫酶的(dí)活性(xìng)。

操作步(bù)驟：

樣(yàng)本處理：

① 96 孔細胞培(péi)養板(bǎn)根據以下分類加樣(yàng)(每(měi)一(yī)種分(fēn)類至少三個(gè)復(fù)孔)：

空白孔(kǒng)：100 μL 無(wú)細胞的培養(yǎng)液(yè)(推薦使用(yòng)含(hán) 1%血清(qīng)的低(dī)血清或無(wú)血

清培養(yǎng)液(yè))；

樣(yàng)本(běn)對照孔(kǒng)：100 μL 待(dài)檢測(cè)細胞(bāo)(約含 5000-10000 個細胞(bāo))；

最大酶(méi)活(huó)對照(zhào)孔：100 μL 待檢(jiǎn)測細胞(約(yuē)含(hán) 5000-10000 個細(xì)胞)；

樣(yàng)本測(cè)定孔：100 μL 待檢測(cè)細(xì)胞(約含(hán) 5000-10000 個(gè)細胞)；

② 將 96 孔細胞(bāo)培養(yǎng)板(bǎn)置於 37°C
，含 5% CO2空氣(qì)及 100%濕度的(dí)細胞培(péi)養箱中培養(yǎng) 24h。

③ 向(xiàng)步(bù)驟②中(zhōng)的空白(bái)孔
，樣(yàng)本(běn)對(duì)照孔(kǒng)中分(fēn)別(bié)加(jiā)入 10μL 的培養(yǎng)液向(xiàng)步驟②中(zhōng)的樣(yàng)本測定(dìng)孔(kǒng)中(zhōng)加(jiā)入 10 μL 不(bù)同(tóng)濃度(dù)的藥(yào)物刺激。

④ 37°C
，含(hán) 5% CO2 空氣(qì)及 100%濕(shī)度的細(xì)胞培養箱中培養(根據不同實(shí)驗細(xì)胞需求(qiú)選擇(zé)適當(dāng)的(dí)孵(fū)育(yù)條(tiáo)件和時(shí)間)。

⑤ 在結(jié)束(shù)培養(yǎng)前 1h 從細(xì)胞培(péi)養箱中取出 96 孔細(xì)胞培養板
，在最(zuì)大酶活對照孔中(zhōng)加入 10 μL 的(dí)試(shì)劑(jì)一
，並(bìng)反復吹打(dǎ)混匀；

⑥ 37°C
，含 5%CO2空(kōng)氣及 100%濕度的細胞(bāo)培(péi)養箱(xiāng)中繼(jì)續培養 1 h；

⑦ 將(jiāng) 96 孔細胞(bāo)培(péi)養(yǎng)板用(yòng)酶(méi)標(biāo)板離(lí)心機 400 x g 離(lí)心 5 min
，吸取(qǔ)上(shàng)清液待測。

注：若(ruò)無(wú)酶(méi)標板離心機
，可(kě)將細胞(bāo)液用移(yí)液(yè)槍(qiāng)吸打(dǎ)均(jūn)匀(yún)後
，移取至離心

管(guǎn)中(zhōng)
，使(shǐ)用普(pǔ)通(tōng)離(lí)心(xīn)機離心(xīn)

樣(yàng)本檢(jiǎn)測：

① 取(qǔ) 96 孔(kǒng)酶標板(bǎn)
，按(àn)上(shàng)述(shù)細(xì)胞培(péi)養過(guò)程(chéng)劃(huá)分為(wéi)空(kōng)白(bái)孔，樣本對照孔，最(zuì)大酶活對(duì)照(zhào)孔和樣本測(cè)定(dìng)孔(kǒng)
，然後向各孔(kǒng)中加(jiā)入50μL對應的待(dài)測上清液。

② 向步驟(zhòu)①酶(méi)標板各(gè)孔中(zhōng)加入50μL反應工作(zuò)液
，酶標(biāo)儀(yí)震(zhèn)板(bǎn)5 s混(hùn)匀。

③ 37°C
，孵(fū)育(yù)10 min；(反應時間可根據顯(xiǎn)色深淺(qiǎn)延長或(huò)縮(suō)短
，建議(yì)測定多個(gè)不同(tóng)時間點(diǎn)的OD值
，以(yǐ)便(biàn)於篩(shāi)選
，盡量控(kòng)製樣(yàng)品對照(zhào)孔(kǒng)的(dí)OD值(zhí)小於0.8
，最大酶(méi)活(huó)對照孔的(dí)OD值小於(yú) 2.0)。

④ 向步(bù)驟(zhòu)③中各孔加入 20μL試劑(jì)五
，混匀
，終(zhōng)止反(fǎn)應。

⑤ 酶標儀上450 nm 波(bō)長處測定各孔OD值
，並設(shè)定600 nm參(cān)比(bǐ)波(bō)長(cháng)
，扣(kòu)除(chú)參比波長(cháng)的OD值(zhí)
，為(wéi)所需(xū)有效(xiào)吸(xī)光(guāng)度(dù)值

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