Elabscience®自(zì)主研(yán)發的(dí) Annexin V-APC/PI Apoptosis Kit
，可用(yòng)於檢測懸浮(fú)細胞(bāo)和(hé)貼(tiē)壁(bì)細胞(bāo)的(dí)凋亡
。 Annexin V 是一種鈣離(lí)子(zǐ)依賴性磷(lín)脂(zhī)結合蛋白(bái)
，與(yǔ)磷脂(zhī)酰(xiān)絲(sī)氨酸(suān) (PS) 有(yǒu)高(gāo)度(dù)親和(hé)力(lì)
。當細(xì)胞(bāo)發生 凋亡時
，膜內側(cè)的磷脂(zhī)酰(xiān)絲氨酸(suān) (PS) 外(wài)翻到膜表麵
，而(ér)被熒(yíng)光染料 APC 標(biāo)記的 Annexin V 結(jié)合(hé)
，可 通過流式(shì)細胞(bāo)儀或熒光顯微(wēi)鏡進(jìn)行檢測
。 由於凋(diāo)亡晚(wǎn)期(qī)或壞死細胞膜喪失(shī)完整性
，而(ér)碘化丙(bǐng)啶（Propidium Iodide, PI）可(kě)與雙鏈(liàn) DNA 特(tè)異(yì) 性(xìng)結合(hé)並產生(shēng)強(qiáng)烈的(dí)熒光
，與(yǔ) Annexin V 搭配使(shǐ)用(yòng)
，可區分處於不(bù)同凋(diāo)亡(wáng)時期的細(xì)胞
。 本(běn)試(shì)劑盒檢測(cè)喜樹鹼(jiǎn)誘(yòu)導(dǎo)的(dí) Jurkat 細胞(bāo)凋亡效果(guǒ)如下圖所(suǒ)示：

實驗操(cāo)作：

一步法

1．細胞按(àn)照實驗(yàn)方(fāng)案(àn)進行凋(diāo)亡誘導
，300×g 離心5 min
，棄上清
，收集細(xì)胞
，PBS洗滌一次
，輕輕重(zhòng)懸細(xì)胞(bāo)並計數
。

2．取(qǔ)1~5×105重(zhòng)懸(xuán)的細(xì)胞(bāo)
，300×g離(lí)心5min
，棄上(shàng)清
。用 PBS 洗滌細(xì)胞一次
，離(lí)心後(hòu)棄上(shàng)清
，加入500μL稀釋的1×Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞
。

3．細胞懸液中加入(rù)5μL的(dí) Annexin V-APC Reagent和5μL的(dí)PI Reagent (50μg/mL)
。

4．輕柔渦旋混(hùn)匀後
，室溫(wēn)避(bì)光(guāng)孵育 15~20 min
。

5．立即上(shàng)機檢測
。如(rú)不能及(jí)時(shí)檢(jiǎn)測(cè)
，請(qǐng)於(yú)冰(bīng)上避(bì)光靜(jìng)置(zhì)並於1小時內完成檢測(cè)
。

注(zhù)：流(liú)式(shì)細(xì)胞儀檢(jiǎn)測時(shí)Annexin V-APC可用APC通(tōng)道(dào)
，PI優先選(xuǎn)擇(zé) ECD 通道(dào)
，其(qí)次是 PE 通(tōng)道(dào)；如果樣本有 FITC通道的(dí)自發(fā)熒光(guāng)
，則(zé)選(xuǎn)PerCP/Cy5.5 通道
。

兩(liǎng)步法

1．細胞(bāo)按照實(shí)驗方(fāng)案進行(háng)凋亡誘導
，300×g離心(xīn)5 min
，棄上清(qīng)
，收(shōu)集細胞(bāo)
，PBS洗滌一次
，輕(qīng)輕(qīng)重懸細胞並(bìng)計(jì)數
。

2．取1~5×105重(zhòng)懸的(dí)細(xì)胞(bāo)
，300×g離(lí)心5min
，棄上(shàng)清(qīng)
。用PBS洗(xǐ)滌細胞一(yī)次(cì)
，離(lí)心(xīn)後棄(qì)上(shàng)清(qīng)
，加(jiā)入100μL稀(xī)釋的(dí)1×Annexin V Binding Buffer重懸細胞
。

3．細胞懸液(yè)中加(jiā)入(rù)2.5μL的Annexin V-APC Reagent和2.5μL的(dí)PI Reagent (50μg/mL)
。（由於兩步法分辨(biàn)率更(gēng)高(gāo)
，染色液用量(liáng)減半(bàn)依(yī)然可得到(dào)媲美一(yī)步法的效果；用戶亦可根據自(zì)己的(dí)模型(xíng)進(jìn)行(háng)滴(dī)定後加(jiā)入適(shì)量(liáng)的(dí)染色液
，用(yòng)更少的量(liáng)獲(huò)得高(gāo)質(zhì)量的結(jié)果(guǒ)
。）

4．輕柔(róu)渦(wō)旋(xuán)混匀後
，室(shì)溫(wēn)避光孵育 15~20 min
。

5．加(jiā)入400μL稀(xī)釋(shì)的 1×Annexin V Binding Buffer
，混匀樣本
。

6．立即(jí)上(shàng)機(jī)檢(jiǎn)測
。如不能及時(shí)檢(jiǎn)測(cè)
，請於(yú)冰(bīng)上(shàng)避(bì)光靜(jìng)置並於1小(xiǎo)時內(nèi)完(wán)成檢測(cè)
。

注(zhù)：流(liú)式(shì)細(xì)胞儀(yí)檢測時Annexin V-APC可(kě)用(yòng)APC通道
，PI優(yōu)先選擇(zé)ECD通道(dào)
，其次是PE通(tōng)道；如(rú)果(guǒ)樣本(běn)有(yǒu)FITC 通道的(dí)自發熒光
，則選(xuǎn)擇(zé)PerCP/Cy5.5通(tōng)道
。

注(zhù)意(yì)事項(xiàng)：

1. 本產品(pǐn)僅(jǐn)供科(kē)研使用
。

2. 檢測(cè)貼(tiē)壁(bì)細胞(bāo)時(shí)
，需(xū)收集誘(yòu)導凋亡後產生的懸浮細胞
，並與後續(xù)收集的貼壁(bì)細胞(bāo)一起(qǐ)檢測(cè)
。

3. 應(yīng)盡量避(bì)免(miǎn)消(xiāo)化(huà)貼(tiē)壁細胞帶(dài)來(lái)的機(jī)械損傷
。同(tóng)時(shí)
，胰酶的(dí)消化(huà)液中(zhōng)應(yīng)盡量不含 EDTA
，因(yīn)為 EDTA

會(huì)影(yǐng)響 Annexin V 與磷(lín)脂酰(xiān)絲(sī)氨酸的(dí)結(jié)合
。

4. 如(rú)果(guǒ)使用(yòng)含 EDTA 的胰(yí)酶(méi)
，收集細胞後(hòu)應(yīng)充分清洗
，確(què)保 EDTA 被去除(chú)幹(gān)淨(jìng)
。

5. 染色(sè)後宜(yí)盡(jìn)快檢(jiǎn)測
，時間(jiān)過(guò)長可能會導致凋(diāo)亡或(huò)壞(huài)死細(xì)胞的數量增(zēng)加
。

6. 熒(yíng)光物質均易(yì)發生淬滅
，在(zài)進(jìn)行熒光觀(guān)察(chá)時
，盡量縮短(duǎn)觀(guān)察(chá)時(shí)間(jiān)
，同(tóng)時(shí)在操(cāo)作和存放(fàng)過(guò)程中(zhōng)也(yě)盡

量(liáng)注意避光保(bǎo)存(cún)
。

7. 為了您的安(ān)全和健康
，請(qǐng)穿(chuān)實(shí)驗服並戴一次性手套(tào)操作

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