感(gǎn)受態(tài)細胞轉化(huà)效率(shuài)高(gāo)達(dá) 108 cfu/µg，具鏈黴素抗性，其轉化(huà)後單菌落的(dí)生長數多，生(shēng)長(cháng)速(sù)度比 DH5α 略快，相(xiāng)同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)生長(cháng)的(dí)菌(jūn)斑略大(dà)於DH5α。適用於(yú)高效的 DNA 克隆和質(zhì)粒(lì)擴增。能保(bǎo)證高(gāo)拷(kǎo)貝質粒的穩(wěn)定復(fù)製。

操作步(bù)驟：

使(shǐ)用前(qián)請先(xiān)在漂洗液PW中加入(rù)無(wú)水乙醇，加(jiā)入體(tǐ)積(jī)請(qǐng)參(cān)照(zhào)瓶上的(dí)標簽。

1. 柱(zhù)平(píng)衡步驟(zhòu)：向吸(xī)附柱CP3中（吸附柱(zhù)放(fàng)入收集(jí)管中(zhōng)）加入500μl的平衡(héng)液(yè)BL，12,000 rpm（~13,400×g）離心(xīn)1 min，倒(dǎo)掉(diào)收集管中的(dí)廢(fèi)液(yè)，將吸附(fù)柱重新(xīn)放回(huí)收集(jí)管(guǎn)中。（使用當天(tiān)處(chǔ)理(lǐ)過的柱子）

2. 取(qǔ)1-5 ml過(guò)夜(yè)培(péi)養(yǎng)的(dí)菌液加入(rù)離心管中，12,000rpm （~13,400×g）離心1 min，盡(jìn)量吸除(chú)上清(qīng)（菌液較多時(shí)可以通過(guò)幾次(cì)離(lí)心將(jiāng)菌體沉(chén)澱收集(jí)到一(yī)個離心管中(zhōng)）。

3. 向留有(yǒu)菌(jūn)體沉(chén)澱(diàn)的離心(xīn)管中(zhōng)加入(rù)250μI溶(róng)液P1（請先檢查是否已加入(rù)RNase A），使用移液器(qì)或渦(wō)旋振蕩器徹di懸浮細菌細胞沉澱。

注意(yì)：如(rú)果(guǒ)有未(wèi)徹(chè)di混(hùn)匀(yún)的菌(jūn)塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏(piān)低(dī)。

4. 向離心(xīn)管中(zhōng)加入(rù)250μl溶(róng)液(yè)P2，溫(wēn)和(hé)地上(shàng)下(xià)翻轉(zhuǎn)6-8次(cì)使(shǐ)菌體充分(fēn)裂(liè)解。

注意：溫和(hé)地混合，不要(yào)劇烈震(zhèn)蕩，以免打(dǎ)斷基因組(zǔ)DNA，造成提取的質粒(lì)中混有基因(yīn)組DNA片斷。此(cǐ)時菌液(yè)應變(biàn)得清亮粘(nián)稠，所(suǒ)用時間不應(yīng)超過5min，以(yǐ)免質(zhì)粒(lì)受(shòu)到(dào)破(pò)壞(huài)。如果未變得清亮，可能(néng)由(yóu)於菌體過多，裂解(jiě)不(bù)徹di，應減少菌體量(liáng)。

5. 向離(lí)心管中加入350μl溶(róng)液P3，立即溫(wēn)和(hé)地(dì)上下(xià)翻(fān)轉(zhuǎn)6-8次(cì)，充分混(hùn)匀(yún)，此(cǐ)時(shí)會出(chū)現白色絮狀(zhuàng)沉澱。12,000rpm（~13,400×g）離(lí)心(xīn)10min，用移液器小心地將上清(qīng)轉移(yí)到(dào)過濾柱CS（過濾柱(zhù)放入收(shōu)集管(guǎn)中(zhōng)），注意(yì)盡(jìn)量不(bù)要吸出沉(chén)澱(diàn)。

注(zhù)意(yì)：P3加(jiā)入後(hòu)應立即混合(hé)，避(bì)免產(chǎn)生局部沉澱。如(rú)果上清中(zhōng)還有微(wēi)小白色(sè)沉澱(diàn)，可(kě)再(zài)次離心(xīn)後(hòu)取上(shàng)清(qīng)。

6. 12,000 rpm（~13,400×g）離心2 min，小心(xīn)地(dì)將(jiāng)離(lí)心後收集管中(zhōng)得到的(dí)溶液(yè)轉(zhuǎn)移(yí)到(dào)吸附柱(zhù)CP3中（吸附柱放(fàng)入收集管(guǎn)中(zhōng)），（如(rú)果(guǒ)過(guò)濾(lǜ)柱中有殘餘的(dí)液體說明步驟5吸取(qǔ)的上(shàng)清(qīng)中雜質過多(duō)，可以(yǐ)延長離心的時間；如(rú)果離(lí)心(xīn)後收集管(guǎn)底(dǐ)部有(yǒu)少量的沉(chén)澱，盡(jìn)量(liáng)的(dí)吸取上(shàng)清）。

7. 12.000 rpm （~13,400×g）離(lí)心(xīn)30-60 sec，倒(dǎo)掉收(shōu)集(jí)管中的(dí)廢液，將吸(xī)附(fù)柱(zhù)CP3放入收集管中。

8.向吸(xī)附柱(zhù)CP3中加(jiā)入(rù)500μl去(qù)蛋(dàn)白(bái)液PD，12,000rpm （~13.400×g）離心(xīn)30-60 sec，倒掉(diào)收(shōu)集(jí)管中(zhōng)的廢液，將吸(xī)附柱CP3放入(rù)收(shōu)集管中(zhōng)。

 9. 向(xiàng)吸(xī)附柱CP3中加入600μl漂(piāo)洗液PW（請先(xiān)檢查(chá)是(shì)否(fǒu)已(yǐ)加入(rù)無(wú)水乙(yǐ)醇），12,000 rpm（~13,400×g）離心30-60 sec，倒掉收(shōu)集管中(zhōng)的廢液，將吸(xī)附柱CP3放入(rù)收集管中。

10.重復操作步(bù)驟9。

11.將吸(xī)附柱CP3放(fàng)入(rù)收集(jí)管中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2 min，目的(dí)是將吸附(fù)柱(zhù)中(zhōng)殘餘(yú)的漂(piāo)洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇(chún)的(dí)殘留(liú)會影(yǐng)響(xiǎng)後(hòu)續的酶反應（酶切(qiē)，PCR等(děng)）實驗。為(wéi)確保下(xià)遊實(shí)驗(yàn)不(bù)受(shòu)殘留(liú)乙醇(chún)的影響，建議(yì)將吸附柱CP3開蓋(gài)，置於室溫放置(zhì)數分鐘(zhōng)，以(yǐ)徹(chè)di晾(liàng)幹吸附(fù)材料(liào)中殘餘(yú)的漂(piāo)洗(xǐ)液。

12.將(jiāng)吸(xī)附柱CP3置於(yú)一個幹淨(jìng)的離(lí)心(xīn)管中(zhōng)，向(xiàng)吸(xī)附(fù)膜的(dí)中間部位(wèi)懸(xuán)空滴加(jiā)50-100μI洗脫(tuō)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)TB，室溫放(fàng)2min,12,000rpm（~13,400×g）離心2min，將質粒溶(róng)液收(shōu)集到離心管中。

注意(yì)：為了增加(jiā)質(zhì)粒的回(huí)收(shōu)效率(shuài)，可(kě)將(jiāng)得(dé)到(dào)的溶液重(zhòng)新加入離(lí)心吸附柱中，重(zhòng)復步(bù)驟(zhòu)12。洗脫液(yè)的pH值(zhí)對(duì)於洗(xǐ)脫效率有(yǒu)很大(dà)影(yǐng)響。若(ruò)用ddH20做洗脫(tuō)液，應保(bǎo)證其pH值在(zài)7.0-8.5範(fàn)圍(wéi)內，pH值低(dī)於(yú)7.0會降低(dī)洗脫(tuō)效率(shuài)。洗(xǐ)脫緩(huǎn)衝(chōng)液體積不應少(shǎo)於50μl，體積過(guò)小影響回(huí)收效率(shuài)。且(qiě)DNA產物應(yīng)保(bǎo)存在-20°C，以(yǐ)防(fáng)DNA降(jiàng)解。

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