DH5α感受(shòu)態(tài)細(xì)胞是(shì)一種常用(yòng)於(yú)質(zhì)粒克(kè)隆(lóng)的(dí)感受態(tài)細胞，其φ80lacZ△M15基因的(dí)產物可(kě)與pUC載(zǎi)體編碼的(dí)β-半乳(rǔ)糖(táng)苷(gān)酶氨基端(duān)實(shí)現α互(hù)補(bǔ)，可用(yòng)於(yú)藍白斑(bān)篩選，轉化(huà)效(xiào)率高(gāo)達108 cfu/µg。recA1和(hé)endA1的(dí)突變(biàn)有利(lì)於克隆(lóng)DNA的穩(wěn)定和(hé)高(gāo)純度質粒 DNA的提取。

天(tiān)根DH5α感受(shòu)態細胞(bāo)(CB101-01)是采(cǎi)用(yòng)大腸杆菌DH5α菌株經特殊工(gōng)藝處理得到(dào)的感(gǎn)受(shòu)態細胞，可(kě)用於DNA的化(huà)學轉化。使用pUC19質粒(隨產品(pǐn)配備，濃(nóng)度(dù)為0.1 ng/µl)檢測(cè)，轉化效(xiào)率(shuài)可達(dá)108cfu/µg，-90~-65℃保(bǎo)存(cún)幾個月轉化效率(shuài)不發(fā)生(shēng)改變。

操(cāo)作步(bù)驟：

1.取(qǔ)感受態細胞(bāo)置(zhì)於冰(bīng)浴中，如(rú)需分裝(zhuāng)可將(jiāng)剛融(róng)化(huà)細胞懸液(yè)分裝到無菌預(yù)冷(lěng)的(dí)離(lí)心管中(zhōng)，置於冰浴中。

注(zhù)意: 一次(cì)轉化(huà)感受(shòu)態(tài)細胞的(dí)建議用量為(wéi)50-100µl，可以根(gēn)據(jù)實際(jì)情況(kuàng)分裝(zhuāng)使用。應(yīng)注(zhù)意(yì)所(suǒ)用(yòng)DNA體(tǐ)積(jī)不要(yào)超(chāo)過(guò)感(gǎn)受態細胞懸(xuán)液體(tǐ)積的(dí)十分(fēn)之一(yī)。以下實驗(yàn)以(yǐ)100µl感(gǎn)受(shòu)態細胞為例。

2.向(xiàng)感受(shòu)態細(xì)胞(bāo)懸液中(zhōng)加(jiā)入目的DNA(100μl的(dí)感受態細胞能(néng)夠被(bèi)1ng超(chāo)螺旋質(zhì)粒(lì)DNA所飽和)，輕彈混匀(yún)，在冰(bīng)浴(yù)中靜置30min。

3. 將離心(xīn)管置於42℃水(shuǐ)浴(yù)中(zhōng)放(fàng)置60-90 sec，然(rán)後(hòu)快(kuài)速將管轉(zhuǎn)移(yí)到冰浴(yù)中，使細胞(bāo)冷卻2-3 min，該(gāi)過程(chéng)不要(yào)搖動(dòng)離心(xīn)管。

注意:此步(bù)驟也(yě)可將離(lí)心管置(zhì)於室溫進行(háng)，時(shí)間不需十分準確，夏(xià)季或室(shì)溫較高(gāo)時，可放置5-8 min左右，如(rú)果室(shì)溫較(jiào)低(dī)，可延(yán)長(cháng)時(shí)間至8-15 min左右。條(tiáo)件(jiàn)允許(xǔ)建議使(shǐ)用(yòng)42℃C熱激(jī)方法。

4.向每(měi)個離心(xīn)管(guǎn)中(zhōng)加(jiā)入900μl無菌(jūn)的SOC或(huò)LB培(péi)養基(不含(hán)抗(kàng)生素)，混匀後置於37℃搖床振蕩培養45min(150rpm)，目(mù)的是使質(zhì)粒上相(xiāng)關(guān)的(dí)抗性(xìng)標記(jì)基(jī)因(yīn)表達(dá)，使(shǐ)菌(jūn)體(tǐ)復(fù)蘇(sū)。

5.將(jiāng)離(lí)心(xīn)管內容(róng)物混匀，吸取(qǔ)100μl已轉(zhuǎn)化(huà)的(dí)感受態細(xì)胞加到含相應抗生素的SOB或(huò)LB固體瓊脂(zhī)培養(yǎng)基上(shàng)，用無菌(jūn)的(dí)彎頭玻棒輕(qīng)輕的(dí)將細(xì)胞均匀塗開。將(jiāng)平(píng)板置(zhì)於室溫直至液體被吸(xī)收，倒置(zhì)平板(bǎn)，37℃培(péi)養12-16 h。

注意:塗(tú)布(bù)用量(liáng)可(kě)根據具體實(shí)驗來調整(zhěng)。如轉(zhuǎn)化(huà)的(dí)DNA總量(liáng)較多(duō)，可取(qǔ)更少(shǎo)量轉化(huà)產(chǎn)物(wù)塗(tú)布(bù)平板;反(fǎn)之，如轉(zhuǎn)化(huà)的(dí)DNA總(zǒng)量(liáng)較(jiào)少(shǎo)，可取(qǔ)200-300μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物塗布(bù)平(píng)板(bǎn)。如果預(yù)計的克隆較少，可(kě)通過離心(xīn)(4000rpm,2 min)後(hòu)吸(xī)除(chú)部分培養(yǎng)液(yè)，懸浮(fú)菌體後將(jiāng)其塗布於(yú)一個平板(bǎn)中(zhōng)。(塗(tú)布(bù)剩餘(yú)的菌液可(kě)置於(yú)4°C保存(cún)，如(rú)果次日(rì)的轉化菌(jūn)落數過(guò)少可(kě)以將剩(shèng)下(xià)的菌液再塗布新的(dí)培養板(bǎn))

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