產品(pǐn)名稱(chēng)：尿液DNA提取試劑(jì)盒（離心柱）

產(chǎn)品貨號：TD361-50 (50 次反(fǎn)應)

產(chǎn)品亮(liàng)點：

從高達40毫(háo)升(shēng)的尿液中(zhōng)輕(qīng)鬆地(dì)純化細(xì)胞(bāo)DNA/cell-free DNA。

試劑盒配套的(dí)尿液(yè)穩(wěn)定(dìng)劑(jì)(UCB)可以使DNA在室(shì)溫(wēn)下穩定保(bǎo)存長(cháng)達1個月(yuè)。

純化柱(zhù)設計確保DNA適用(yòng)於所有敏感(gǎn)的(dí)下(xià)遊應(yīng)用，包括(kuò)PCR，DNA測序，芯片和(hé)DNA甲基(jī)化(huà)分析(xī)等(děng)

技術簡介(jiè)：

樣品來源(yuán)-尿(niào)液樣(yàng)本，每次(cì)製備(bèi)最多40ml的尿液(yè)。如(rú)有(yǒu)需要，樣(yàng)品(pǐn)體(tǐ)積(jī)可(kě)按比例增加或減(jiǎn)少。

DNA質量-高(gāo)質量的(dí)DNA可用於下遊應(yīng)用，如(rú)PCR，亞硫(liú)酸(suān)鹽(yán)處(chǔ)理(lǐ)/甲基(jī)化(huà)檢測，芯片等。

DNA產量(liáng)-柱(zhù)子(zǐ)的(dí)DNA結(jié)合(hé)容量(liáng)為5 u8。請注意，DNA產量可能會因尿(niào)液(yè)本(běn)身而(ér)異。女性尿液通(tōng)常(cháng)比(bǐ)男性尿液(yè)產生更(gēng)多的(dí)DNA。健康(kāng)女(nǚ)性(xìng)個(gè)體的尿液(yè)DNA平均(jūn)範圍(wéi)為6-1000ng/ml。健(jiàn)康(kāng)男(nán)性個(gè)體的DNA平均(jūn)範圍2-20ng/ml

DNA大小(xiǎo)-能夠(gòu)從100 bp到23 kb恢(huī)復DNA片段。

所(suǒ)需(xū)設備-離(lí)心(xīn)機，微離心機(jī)和(hé)熱塊(kuài)/水浴。

緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)製(zhì)備：

將(jiāng)48ml100%乙醇(52ml95%乙醇)加入12ml尿液DNA洗滌(dí)緩(huǎn)衝(chōng)液2中，添加(jiā)好乙(yǐ)醇後(hòu)在試劑瓶上(shàng)做好(hǎo)標記！

選(xuǎn)擇性(xìng)添加(jiā)項(xiàng):如遇難(nán)處(chǔ)理(lǐ)樣品，可以考慮(lǜ)向基因(yīn)組(zǔ)DNA裂解液(yè)中加入B-巰(qiú)基乙醇(chún)(用戶自(zì)備)，最終(zhōng)稀(xī)釋(shì)為(wéi)0.5%(v/v)，即(jí)每50ml加入(rù)250微升

實驗流程(chéng)：

從(cóng)≤40ml的樣(yàng)品(pǐn)中提取(qǔ) DNA

除非特(tè)殊(shū)說(shuō)明，一(yī)般在(zài)常(cháng)溫(wēn)(15-30°C)進(jìn)行以下(xià)操作步(bù)驟。 以下(xià)操作步(bù)驟分(fēn) 3 個部(bù)分:(A)總DNA(細胞內和遊離(lí))沉(chén)澱(diàn)

(B)蛋白消化(huà)

(C)DNA 純化。

(A)總(zǒng)DNA(細胞內(nèi)和遊離)沉澱

(如(rú)果隻需要(yào)細胞(bāo)內或(huò)者遊(yóu)離(lí)的(dí) DNA,操作(zuò)步驟見附錄)1.將 40ml 的(dí)尿(niào)液轉移(yí)到合(hé)適的離心(xīn)管內。

注:如果處理≤1毫(háo)升(shēng)的(dí)尿(niào)液，請(qǐng)使(shǐ)用微離心管(guǎn)。

如果處(chǔ)理>1毫(háo)升(shēng)至(zhì)14毫(háo)升的尿液(yè)，請(qǐng)使用15毫升的(dí)錐(zhuī)形(xíng)管。

如(rú)果處理(lǐ)>14毫升(shēng)至(zhì)40毫升的尿(niào)液，請使(shǐ)用50毫升的(dí)錐(zhuī)形管(guǎn)。

2.添加 70ul 的尿(niào)液穩定劑(jì)到每(měi) 1m!的樣品中，渦(wō)旋混(hùn)匀。(例如 350ul 的尿(niào)液穩(wěn)定劑(jì)到 5ml的尿液樣品中)

添加(jiā)了(liǎo)穩(wěn)定劑的(dí)尿液可(kě)以在(zài)室溫(wēn)下最(zuì)長保存 1 個月，需要提取(qǔ)核酸(suān)時，將添(tiān)加(jiā)了穩定(dìng)劑的尿液(yè)渦(wō)旋(xuán)振蕩，混匀。

如果(guǒ)處(chǔ)理(lǐ)≤14ml的尿(niào)液添(tiān)加 10ul純(chún)化珠(使(shǐ)用之前需要(yào)渦(wō)旋混(hùn)匀(yún))3.

如果(guǒ)處(chǔ)理 14-40m!的(dí)尿液，需要(yào)添(tiān)加 20ul 純化(huà)珠(使用之(zhī)前需(xū)要(yào)渦(wō)旋混(hùn)匀(yún))。

4.在 3，000xg 下離心 15 分鐘(zhōng)。收(shōu)集(jí)細胞(bāo)沉(chén)澱(diàn)。操(cāo)作方(fāng)案：

以下離心(xīn)操(cāo)作步驟(zhòu)的離心力(lì)均(jūn)在 10,000 - 16,000 x g 之間(jiān)進行(háng)。

1. 使用刀片或(huò)手術(shù)刀把(bǎ) DNA 片(piàn)段(duàn)從瓊脂(zhī)糖(táng)凝膠上切除(chú)下來並(bìng)且(qiě)移置到(dào) 1.5 ml 小(xiǎo)型(xíng)離(lí)心(xīn)管內.

Note: 從(cóng)凝膠上(shàng)切下(xià)的瓊脂糖(táng)盡可能(néng)的要少(shǎo).

2. 將(jiāng) 3 倍(bèi)體(tǐ)積的 溶(róng)膠(jiāo)液 添加到每 1 體(tǐ)積(jī)從凝膠上(shàng)切下(xià)的瓊脂糖切(qiē)塊中.

Example:對(duì) 於 200 µl (mg) 的(dí) 瓊 脂(zhī) 糖 凝 膠(jiāo) 切 塊(kuài) ， 添(tiān) 加(jiā) 600 µl 的(dí) ADB 緩衝(chōng)液.

3. 在(zài) 37-55℃ 下溫(wēn)水浴 10~20 分(fēn)鐘直(zhí)到凝(níng)膠切塊(kuài)溶解(jiě).

Note: 確(què)定(dìng)凝(níng)膠切(qiē)塊溶(róng)解是很重(zhòng)要的步驟. 在溫水浴(yù)過程中(zhōng)可輔以溫和的(dí)攪(jiǎo)拌有助於凝(níng)膠(jiāo)的(dí)溶解(jiě)。 如果(guǒ) DNA 大小(xiǎo)超(chāo)過(guò) 8kb ，加熱之(zhī)後需(xū)要額外(wài)添加(jiā)等量(liáng)膠塊體(tǐ)積的(dí)水(shuǐ)。例如： 200 µl (mg) 的(dí)瓊(qióng)脂(zhī)糖(táng)凝(níng)膠(jiāo)切(qiē)塊，添加 600 µl 的(dí) ADB 緩(huǎn)衝液(yè).加(jiā)熱之後添(tiān)加(jiā) 200µl 的(dí)水。

4. 將(jiāng)溶(róng)解的(dí)瓊脂糖切(qiē)塊溶(róng)液放到 2 號柱 中並(bìng)把(bǎ)柱套在 收(shōu)集管 裏(lǐ).

5. 離心 1 分鐘. 去除濾出(chū)液(yè). Note: 柱所能(néng)容(róng)納的樣品體積為 800 µl. 所以(yǐ), 如(rú)果(guǒ)樣品(pǐn)體(tǐ)積(jī)超過(guò) 800 µl 時，柱就要被多(duō)次填(tián)充和離心。

6. 添加(jiā) 200 µl 的(dí) DNA 洗滌(dí)液 到(dào)柱(zhù)中(zhōng)離(lí)心 1 分鐘，去除濾出液.

7. 重(zhòng)復(fù)第 6 步(bù)洗滌步驟.

8. 可(kě)選步(bù)驟(zhòu)：將收(shōu)集管中的廢液倒掉，並將 2 號(hào)柱套回收集(jí)管(guǎn)中額(é)外離心2 分鐘(zhōng)，盡量(liáng)除去洗滌(dí)液(yè)，以免洗(xǐ)滌(dí)液中殘(cán)留乙醇抑製下(xià)遊反應。

9. 直接(jiē)添加(jiā) 25 µl DNA 洗脫液到柱基質中(zhōng). 將(jiāng)柱套在 1.5 ml 離心(xīn)管中離心 1 分鐘(zhōng)來洗(xǐ)脫(tuō)

DNA.Note :從(cóng)柱中(zhōng)洗脫(tuō)出的(dí) DNA 產量(liáng)與(yǔ) pH 和(hé)溫(wēn)度有(yǒu)關. 如果(guǒ)使用水來(lái)洗(xǐ)脫， 確保 pH 是>6.0. 在向柱(zhù)中(zhōng)加(jiā)入水(shuǐ)後靜置 1 分鐘(zhōng)可增加(jiā)較大(dà) (> 6 kb) DNA 的(dí)產量.在 60-70 oC 的水(shuǐ)中洗脫(tuō) DNA 可增(zēng)加(jiā)較大(dà)DNA(> 10 kb)的產(chǎn)量

Note: 如果試驗(yàn)需要(yào)的話(huà) TE 緩(huǎn)衝液 (10 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA， pH 8.0) 或改進(jìn)的(dí)TE (10 mMTris-HCl， 0.1 mM EDTA， pH 8.5) 也可用(yòng)來洗脫(tuō).

在(zài)水中(zhōng)得到的(dí)超純 DNA 可(kě)進(jìn)行後續試驗.

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