產品(pǐn)名(míng)稱(chēng)：abcam重(zhòng)組(zǔ)Drebrin抗體[EPR12634] (ab178408)現(xiàn)貨供應(yīng)

產品(pǐn)貨號(hào)：ab178408

產(chǎn)品(pǐn)品牌：abcam

實驗流(liú)程：

蛋白質印(yìn)跡實驗(yàn)方案：

1. 樣(yàng)品裂解

l 從(cóng)細胞培(péi)養物中製備(bèi)裂(liè)解物

(1) 將細胞(bāo)培(péi)養(yǎng)皿放(fàng)在(zài)冰上
，用冰冷(lěng)的(dí)PBS清洗細(xì)胞。

(2) 吸出(chū) PBS
，然後加入冰冷(lěng)的裂解緩衝(chōng)液（每 10 mL7細(xì)胞/100 mm 培(péi)養皿(mǐn)/150 cm2瓶;每(měi) 5x10 0.5 mL6細胞/60 mm 培養皿/75 cm2燒瓶）。

(3) 使(shǐ)用(yòng)冷(lěng)塑(sù)料細胞(bāo)刮刀從(cóng)培養皿(mǐn)上刮(guā)下(xià)貼壁(bì)細(xì)胞
，然(rán)後輕(qīng)輕地將(jiāng)細胞懸液轉移到(dào)預冷的微量(liáng)離(lí)心管中(zhōng)。或(huò)者
，在微量(liáng)離心(xīn)管(guǎn)中(zhōng)的裂解緩衝液(yè)中重懸之前
，可以胰(yí)蛋白酶消化並用PBS洗滌細(xì)胞。

(4) 在 4°C 下保持(chí)恒定(dìng)攪拌 30 分鐘(zhōng)。

(5) 在(zài)4°C的微量離(lí)心(xīn)機(jī)中(zhōng)離心(xīn)細(xì)胞懸液。 您(nín)可能(néng)需(xū)要根據(jù)細胞(bāo)類型改變離心力(lì)和時間;指(zhǐ)南(nán)是在(zài) 14,000–17,000 g 下 5 分鐘(zhōng)
，但這(zhè)必(bì)須(xū)為您的實驗確定（白(bái)細胞需(xū)要非(fēi)常(cháng)輕的離心）。

(6) 輕(qīng)輕(qīng)地從離(lí)心(xīn)機(jī)中(zhōng)取(qǔ)出試(shì)管(guǎn)並(bìng)放在冰上(shàng)
，吸出上清液(yè)並(bìng)放(fàng)入保(bǎo)持在冰(bīng)上的新鮮(xiān)試管中(zhōng)
，然後(hòu)丟棄沉(chén)澱(diàn)。

l 從組(zǔ)織中製(zhì)備裂(liè)解(jiě)物

(1) 用幹(gān)淨(jìng)的工具解剖(pōu)感(gǎn)興(xīng)趣的組(zǔ)織
，最(zuì)好(hǎo)在(zài)冰上解(jiě)剖(pōu)
，並盡(jìn)快防(fáng)止(zhǐ)蛋白(bái)酶(méi)降解。

(2) 將組織放入圓底微(wēi)量離心(xīn)管(guǎn)或Eppendorf管(guǎn)中(zhōng)
，並(bìng)浸(jìn)入液氮中以快(kuài)速冷(lěng)凍(dòng)。將樣品儲存在 -80°C 以備後用
，或放(fàng)在冰上(shàng)立即均質化。對於~5mg組織
，向(xiàng)試管中(zhōng)快(kuài)速加入~300μL冰(bīng)冷裂(liè)解緩(huǎn)衝液(yè)
，用電動均(jūn)質器(qì)匀(yún)漿(jiāng)
，用另(lìng)一個2×200μL裂解緩(huǎn)衝(chōng)液衝洗刀(dāo)片兩次
，然(rán)後在4°C下(xià)保持(chí)恒(héng)定攪(jiǎo)拌2小時（例如
，放在冰箱(xiāng)中的軌道振(zhèn)蕩(dàng)器(qì)上）。裂解緩衝(chōng)液的體積(jī)必須根據存(cún)在(zài)的(dí)組織量來(lái)確定;蛋(dàn)白質(zhì)提(tí)取物不應(yīng)太稀釋(shì)
，以免(miǎn)蛋(dàn)白質(zhì)損(sǔn)失(shī)和(hé)大量(liáng)樣品上(shàng)樣(yàng)到(dào)凝(níng)膠上。濃(nóng)度下限(xiàn)為(wéi) 0.1 mg/mL
，最佳(jiā)濃度(dù)為(wéi) 1–5 mg/mL。

(3) 在(zài)微(wēi)量(liáng)離心(xīn)機(jī)中(zhōng)以 14,000–17,000 g 在 4°C 下(xià)離心 5–10 分鐘(zhōng)。輕(qīng)輕地從離(lí)心機(jī)中取(qǔ)出(chū)試管(guǎn)
，放在冰上
，吸出(chū)上清液(yè)
，然後放入(rù)保持在(zài)冰(bīng)上的新(xīn)鮮(xiān)試(shì)管中(zhōng);丟(diū)棄顆(kē)粒(lì)。

2. 樣(yàng)品(pǐn)製備

(1) 除去(qù)少量裂解物(wù)以進行(háng)蛋白質定(dìng)量測定。確(què)定(dìng)每(měi)種(zhǒng)細胞(bāo)裂解(jiě)物(wù)的(dí)蛋(dàn)白(bái)質(zhì)濃度(dù)。

(2) 確定(dìng)要加載(zǎi)多(duō)少蛋(dàn)白質並加入(rù)等(děng)體(tǐ)積(jī)的(dí) 2X Laemmli 樣品緩(huǎn)衝液。

(3) 我(wǒ)們(mén)建(jiàn)議使(shǐ)用以下方(fāng)法對樣(yàng)品(pǐn)進行還(huán)原和(hé)變(biàn)性(xìng)
，除(chú)非在綫抗體數據表(biǎo)表(biǎo)明(míng)應(yīng)使(shǐ)用非還(huán)原(yuán)和(hé)非變(biàn)性條件(jiàn)。

(4) 為(wéi)了(liǎo)減少樣(yàng)品和變性(xìng)
，將每個(gè)細胞裂(liè)解物在樣品緩衝液中在100°C下煮(zhǔ)沸5分鐘(zhōng)。裂(liè)解物(wù)可以(yǐ)等分並儲存在 -20°C 以(yǐ)備將來(lái)使(shǐ)用。

3. 抗(kàng)體(tǐ)染色

(1) 使用封(fēng)閉緩衝(chōng)液在室(shì)溫下封閉膜(mó)1小(xiǎo)時(shí)或在4°C下(xià)過夜(yè)。

(2) 在(zài)封閉(bì)緩(huǎn)衝(chōng)液中(zhōng)用適(shì)當(dāng)稀釋的一(yī)抗(kàng)孵育(yù)膜。我們(mén)建(jiàn)議(yì)在(zài) 4°C 下孵(fū)育過夜;其他條件可以優(yōu)化。

(3) 用三次(cì)TBST洗(xǐ)滌膜
，每次5分(fēn)鐘。

(4) 在(zài)室(shì)溫下
，在(zài)封(fēng)閉緩衝液(yè)中用推薦(jiàn)的偶聯二(èr)抗稀(xī)釋液孵育膜(mó)1小時。

(5) 用三次TBST洗滌膜
，每(měi)次5分鐘(zhōng)。

(6) 對於信(xìn)號開發
，請遵循(xún)套件(jiàn)製造商(shāng)的(dí)建議(yì)。去(qù)除多(duō)餘(yú)的試劑(jì)並用(yòng)透明(míng)保鮮膜(mó)覆蓋膜。

(7) 使(shǐ)用用於化(huà)學(xué)發光的(dí)暗室顯影技(jì)術或(huò)用(yòng)於比色(sè)檢(jiǎn)測(cè)的普通圖像掃(sǎo)描方法獲(huò)取圖(tú)像。

相關文(wén)獻：

[1] Brezovakova V et al. Astrocytes Derived from Familial and Sporadic Alzheimer's Disease iPSCs Show Altered Calcium Signaling and Respond Differently to Misfolded Protein Tau. Cells 11:N/A (2022).

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