一，實驗原理

‌鎳(niè)柱(zhù)純(chún)化(huà)實驗(yàn)的(dí)原理基(jī)於(yú)固定化金(jīn)屬離子(zǐ)親和(hé)色(sè)譜(IMAC)‌，這(zhè)是一種利用金(jīn)屬離子(zǐ)與(yǔ)配體之(zhī)間的(dí)特(tè)異(yì)性相(xiāng)互作(zuò)用來分(fēn)離蛋白質(zhì)的方法(fǎ)。鎳柱(zhù)純化利(lì)用(yòng)Ni2+與(yǔ)帶有咪唑基(jī)團的組氨(ān)酸(suān)(His)標簽的蛋白質之間(jiān)的(dí)相(xiāng)互作(zuò)用(yòng)，從而(ér)實(shí)現目的蛋(dàn)白的純化(huà)。具體來(lái)說，鎳柱中(zhōng)含有(yǒu)Ni2+離(lí)子，這些離(lí)子(zǐ)能夠(gòu)與組(zǔ)氨酸上(shàng)的(dí)咪唑基(jī)團形(xíng)成配位鍵，從(cóng)而(ér)選(xuǎn)擇(zé)性結合帶(dài)有His標(biāo)簽的目的蛋白(bái)。由(yóu)於(yú)不(bù)帶His標簽的蛋白(bái)無法(fǎ)與(yǔ)Ni2+形成(chéng)配(pèi)位鍵(jiàn)，因此(cǐ)能夠有(yǒu)效地(dì)區分目的蛋白(bái)與非目的(dí)蛋(dàn)白。

在純化(huà)過(guò)程中(zhōng)，首先(xiān)通過Binding buffer平(píng)衡(héng)鎳柱，接著將(jiāng)蛋白(bái)質樣(yàng)品上(shàng)樣到鎳(niè)柱上。此(cǐ)時，帶有(yǒu)His標(biāo)簽的(dí)目的(dí)蛋白(bái)會與(yǔ)鎳柱上(shàng)的(dí)Ni2+結(jié)合(hé)，而非(fēi)目(mù)的蛋白則流(liú)穿鎳(niè)柱。隨後，通(tōng)過(guò)增加咪(mī)唑(zuò)濃度(dù)的(dí)Washing buffer洗去非(fēi)特異性結合的雜蛋白。最(zuì)後(hòu)，使用高濃(nóng)度(dù)的咪唑緩衝液(yè)（Elution buffer）與(yǔ)His標簽(qiān)競爭結合Ni2+，從而(ér)將目的蛋(dàn)白洗脫(tuō)下(xià)來，完成(chéng)純化過(guò)程。

二，操作(zuò)步(bù)驟

① 準備工(gōng)作(zuò)：

（1）根(gēn)據目的蛋白的(dí)性質(zhì)，選(xuǎn)擇(zé)合適的(dí)鎳(niè)柱類型和(hé)洗脫(tuō)方(fāng)式，配製合(hé)適PH值(zhí)的緩(huǎn)衝液和洗脫液。

（2）緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)和(hé)洗脫液在(zài)蛋(dàn)白純化操(cāo)作(zuò)前用0.45 μm或0.22 μm濾頭(tóu)過(guò)濾(lǜ)除(chú)菌避免汙染鎳柱，減少(shǎo)壽命。

② 樣品預(yù)處(chǔ)理：

預處理待純化的(dí)蛋(dàn)白(bái)樣(yàng)品，如(rú)離心(xīn)去除雜(zá)質，調(tiáo)整樣品的pH值，低(dī)濃度(dù)咪(mī)唑(zuò)溶液(yè)透(tòu)析以去(qù)除培養基中的(dí)EDTA和鹽溶液等（具體操(cāo)作(zuò)需(xū)根據(jù)蛋白(bái)性質設計(jì)）。

③ 鎳柱平(píng)衡及上樣(yàng)：

利(lì)用(yòng)無咪唑(zuò)或(huò)低濃度咪唑的(dí)緩衝(chōng)液(yè)對(duì)鎳柱進行(háng)平衡，待曲綫維(wéi)穩10 min左右，即平(píng)衡(héng)結(jié)束。平衡(héng)完成後，將(jiāng)處理(lǐ)完畢的樣品(pǐn)緩(huǎn)慢且(qiě)匀速(sù)地加入鎳柱中，使(shǐ)目的(dí)蛋白與(yǔ)鎳(niè)柱充分(fēn)結合(hé)。

④ 除(chú)雜：

使(shǐ)用低濃度咪(mī)唑緩衝(chōng)液（如2，5 ，10，20，25 mM咪(mī)唑）衝洗鎳柱，去除與鎳(niè)柱非特異(yì)性(xìng)結合(hé)的雜(zá)蛋(dàn)白(bái)。該(gāi)過程應合理控(kòng)製(zhì)流速和(hé)時間，以(yǐ)確(què)保(bǎo)雜蛋(dàn)白(bái)被wan全去除。

⑤ 洗(xǐ)脫：

為(wéi)收集高純度的目(mù)的蛋(dàn)白(bái)，使用含(hán)有(yǒu)高(gāo)濃(nóng)度(dù)咪(mī)唑的(dí)洗脫液(yè)將(jiāng)目的蛋白從鎳(niè)柱上(shàng)洗(xǐ)脫下來。通過(guò)梯度洗脫的方式(shì)，逐(zhú)步(bù)增加洗脫(tuō)液中咪唑的濃度（如(rú)50，100，200，300，400，500 mM咪唑(zuò)）。在(zài)目的(dí)蛋(dàn)白shou次純(chún)化實驗中，應設置多個從低至高(gāo)咪唑(zuò)濃度的緩衝液，探(tàn)索合適的洗(xǐ)脫(tuō)條(tiáo)件(jiàn)。

⑥ 收集與分(fēn)析(xī)：

收(shōu)集含(hán)目(mù)的(dí)蛋白的洗脫液樣品，利用SDS-PAGE電泳(yǒng)等方(fāng)法對(duì)其進行(háng)分析(xī)以評估(gū)其純(chún)度和(hé)濃度。

⑦ 清洗與(yǔ)保存：

使用(yòng)ddH₂O衝(chōng)洗(xǐ)鎳柱，並用20%乙(yǐ)醇(chún)溶液(yè)衝洗並(bìng)保(bǎo)存(cún)鎳(niè)柱以(yǐ)防止(zhǐ)微生物生(shēng)長。

三(sān)，注(zhù)意事項(xiàng)

① 在實驗(yàn)前查詢(xún)並(bìng)了解目(mù)的(dí)蛋白(bái)的(dí)性質（分子量(liáng)，等電點，氨(ān)基(jī)酸組(zǔ)成，聚(jù)體(tǐ)等），並嚴格控製(zhì)實(shí)驗條件，如緩衝液的pH值和(hé)咪唑濃(nóng)度，以確保實(shí)驗的準確性和(hé)可(kě)重復(fù)性。

② 嚴格按(àn)照(zhào)說明(míng)書操作，並且(qiě)樣品在上柱前需(xū)要進行(háng)預處(chǔ)理(lǐ)（高(gāo)速離心(xīn)，調PH或透(tòu)析(xī)等），以(yǐ)保護(hù)鎳(niè)柱，避免汙染(rǎn)和(hé)損(sǔn)傷(shāng)。

③ 在鎳柱的(dí)使用(yòng)中(zhōng)，應(yīng)避(bì)免緩衝(chōng)液(yè)中存(cún)在(zài)還原(yuán)劑和(hé)螯合(hé)劑，以免 Ni²⁺ 被還(huán)原(yuán)而(ér)脫(tuō)落(là)。

④ 鎳柱純(chún)化(huà)的效(xiào)率受(shòu)到多種(zhǒng)因(yīn)素的影響，包括蛋白(bái)質表麵可結合的(dí)氨(ān)基(jī)酸(suān)的(dí)種類(lèi)，數(shù)目和(hé)分布(bù)，金屬離子的種類和(hé)密度，以(yǐ)及(jí)層析(xī)條件（如pH值，鹽(yán)的種類和濃(nóng)度(dù)，添加(jiā)劑等）。通(tōng)過(guò)優化(huà)這(zhè)些條件，可以提高純化的效(xiào)率和(hé)目的(dí)蛋(dàn)白(bái)的(dí)純度(dù)。此(cǐ)外(wài)，鎳柱在(zài)使用(yòng)一段時間後可能需(xū)要再(zài)生，以(yǐ)去(qù)除積累(léi)的(dí)雜蛋(dàn)白(bái)並(bìng)重(zhòng)新(xīn)活(huó)化(huà)鎳(niè)柱，以(yǐ)保證其(qí)長期(qī)有效(xiào)的(dí)使(shǐ)用‌。

⑤ 盡(jìn)量(liáng)收(shōu)集鎳(niè)柱(zhù)純(chún)化過程中(zhōng)每(měi)一步(bù)產生的洗脫液，以便實(shí)驗結(jié)束後利用(yòng)SDS-PAGE等方(fāng)法對(duì)蛋白純化過程進行進一步分析。

四，緩(huǎn)衝液推(tuī)薦

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