一，擴增曲綫

擴(kuò)增(zēng)曲綫是(shì)描述PCR動(dòng)態進程的曲(qū)綫，擴增(zēng)曲綫(xiàn)一般(bān)以循(xún)環數(shù)(Cycle number)為橫坐標(biāo),熒光(guāng)強(qiáng)度(Fluorescence intensity)或信號量(liáng)(Signal amount)為縱(zòng)坐(zuò)標(biāo)。典型的擴(kuò)增(zēng)曲(qū)綫可以(yǐ)分(fēn)成(chéng)四(sì)個(gè)時期：基綫期(qī)，指數(shù)期(qī)，綫性期和(hé)平台期。

基綫(xiàn)期：擴增(zēng)曲綫的水平(píng)部分(fēn)，通常在(zài)PCR反應(yīng)的(dí)前(qián)幾個(gè)循環(huán)（3-15個(gè)循環）內(nèi)。此階段(duàn)擴(kuò)增的熒(yíng)光(guāng)信號(hào)被(bèi)熒光背景信(xìn)號(hào)所掩(yǎn)蓋，無法(fǎ)判斷(duàn)產(chǎn)物(wù)生(shēng)成(chéng)量的變(biàn)化。儀(yí)器(qì)軟(ruǎn)件(jiàn)會基於(yú)這(zhè)階(jiē)段(duàn)的(dí)熒(yíng)光信號計(jì)算出(chū)基綫範(fàn)圍。

指數(shù)期：PCR擴(kuò)增的指數增長階段，擴增(zēng)曲綫(xiàn)起(qǐ)峰(fēng)。此(cǐ)時(shí)期(qī)所有(yǒu)反應試(shì)劑均有盈餘(yú)，DNA聚(jù)合(hé)酶保(bǎo)持高(gāo)水(shuǐ)平的活(huó)力，每(měi)個循環的產(chǎn)物量與初(chū)始模板量符合指(zhǐ)數(shù)關係。這(zhè)是(shì)進行(háng)定量分(fēn)析的(dí)最佳(jiā)時期，因為PCR產(chǎn)物(wù)量的對(duì)數值(zhí)與起始模(mó)板量之間存在綫性關係。

綫性(xìng)期：隨(suí)著(zhuó)原料(liào)的消耗，產物的積累，酶活(huó)的(dí)損(sǔn)耗等(děng)，DNA的擴增不再(zài)呈指數擴增，熒(yíng)光信號的增(zēng)長也(yě)逐漸放緩，反應效率(shuài)降(jiàng)低(dī)。產物量(liáng)與(yǔ)初始模板量不(bù)再(zài)符(fú)合(hé)指數關(guān)係。

平台(tái)期(qī)：由(yóu)於底(dǐ)物耗(hào)盡，酶(méi)活性降低等(děng)因(yīn)素，熒(yíng)光信號不再增(zēng)加，趨於平穩。每個(gè)反應進(jìn)入平台(tái)期的時(shí)間(jiān)和(hé)平(píng)台期的高(gāo)低各(gè)不相同。

二(èr)，熔(róng)解曲(qū)綫(xiàn)

熔解(jiě)曲(qū)綫(xiàn)（Dissociation curve）是隨溫度升(shēng)高DNA的雙螺(luó)旋結(jié)構降解程度(dù)的曲綫。它用(yòng)於(yú)分析PCR產物的(dí)濃度(dù)，特點和(hé)純度。

原理(lǐ)：PCR反應結(jié)束後，通(tōng)過(guò)逐漸(jiàn)增(zēng)加溫度同時(shí)監(jiān)測每(měi)一(yī)步的(dí)熒光信號(hào)來(lái)產生熔解曲綫。隨著(zhuó)溫(wēn)度(dù)上升，DNA雙(shuāng)鏈逐漸解開，熒(yíng)光(guāng)染料(liào)從雙鏈中(zhōng)釋(shì)放出來(lái)，熒光信號降(jiàng)低(dī)。當(dāng)溫(wēn)度達到(dào)DNA雙鏈解鏈50%時，對應的溫度(dù)稱(chēng)為熔解(jiě)溫(wēn)度(dù)（Tm）。

曲綫(xiàn)分析(xī)：

單峰曲(qū)綫：如(rú)果qPCR產(chǎn)物非常(cháng)特(tè)異(yì)，熔(róng)解(jiě)曲(qū)綫在80-90℃之間(jiān)會形(xíng)成(chéng)一(yī)個單峰(fēng)。這表(biǎo)明隻擴增到了(liǎo)目(mù)的基(jī)因，沒(méi)有(yǒu)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

前(qián)置(zhì)雜(zá)峰(fēng)：在主峰前有(yǒu)一個(gè)前(qián)鋒，可能是比目的片段(duàn)短些(xiē)的(dí)非(fēi)特異性片段，在(zài)溫(wēn)度(dù)低(dī)一些的(dí)時候(hòu)就能解(jiě)開(kāi)雙(shuāng)鏈，也可(kě)能(néng)是(shì)引(yǐn)物二聚(jù)體。

後置雜峰(fēng)：躲(duǒ)在(zài)主峰後麵的(dí)是比(bǐ)目的片(piàn)段長(cháng)些(xiē)的(dí)非特(tè)異性片段(duàn)，在溫度高一些(xiē)的時候(hòu)才能(néng)解開雙鏈。

寬峰(fēng)：如果非特異性產物(wù)Tm值與目的條(tiáo)帶的(dí)Tm值接(jiē)近，熔(róng)解曲綫可能(néng)出現寬(kuān)峰。

擴增(zēng)循環(huán)數（Cycle Threshold，Ct）在(zài)qPCR（實時熒光定(dìng)量PCR）中是一(yī)個(gè)關(guān)鍵(jiàn)參數，代(dài)表PCR擴增(zēng)過程中，熒光(guāng)信號(hào)達(dá)到設定的(dí)熒光(guāng)閾值(zhí)時(shí)所對(duì)應的擴(kuò)增循(xún)環(huán)數。

三，Ct值的定(dìng)義

Ct值：全稱為Cycle Threshold，即(jí)在PCR反應(yīng)中(zhōng)，每個反(fǎn)應管內的(dí)熒(yíng)光信(xìn)號達到(dào)設(shè)定的(dí)閾值(zhí)時所(suǒ)經(jīng)歷(lì)的(dí)循環數。簡單來說(shuō)，就(jiù)是熒(yíng)光信(xìn)號(hào)開始由本(běn)底(dǐ)進入指數增(zēng)長階段的拐點所(suǒ)對應(yīng)的(dí)循(xún)環(huán)次數(shù)。

Ct值(zhí)的(dí)意義(yì)與範圍(wéi)

Ct值與(yǔ)模(mó)板量(liáng)的關係：衡(héng)量PCR擴增過(guò)程中熒光(guāng)信(xìn)號(hào)達到設(shè)定閾值(zhí)的(dí)循環(huán)次(cì)數。‌ Ct值越小(xiǎo)，表(biǎo)示樣本中(zhōng)靶(bǎ)標核(hé)酸的起(qǐ)始拷貝數(shù)越多；Ct值(zhí)越大(dà)，則表示起始拷貝數(shù)越(yuè)少‌Ct值(zhí)與(yǔ)起始模板量(liáng)的對數存在綫(xiàn)性(xìng)關係。

Ct值的範圍：在正常情(qíng)況下(xià)，Ct值(zhí)的範(fàn)圍通常(cháng)在(zài)15-35之(zhī)間。Ct值小(xiǎo)於15可(kě)能意味著(zhuó)擴增在(zài)基(jī)綫期範(fàn)圍內，未(wèi)達到熒(yíng)光(guāng)閾(yù)值(zhí)；而(ér)Ct值(zhí)大(dà)於35則可能(néng)意(yì)味(wèi)著(zhuó)模板(bǎn)起(qǐ)始拷(kǎo)貝(bèi)數過(guò)低，擴(kuò)增效率不(bù)佳(jiā)或存(cún)在(zài)非特(tè)異性擴增，結(jié)果(guǒ)無(wú)意義(yì)。

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