本(běn)文(wén)介(jiè)紹(shào)一下用(yòng)匀(yún)漿(jiāng)器(qì)研磨法提(tí)取(qǔ)貼壁細胞核蛋(dàn)白的具(jù)體(tǐ)操作
。

一，前(qián)期(qī)準(zhǔn)備

1，台盼藍染液：

取(qǔ)台(tái)盼(pàn)藍(lán)粉劑(jì)，將其溶解在10mL的雙蒸水當中(zhōng)配製成質量體積(jī)比(bǐ)為(wéi)4%（4%w/v）的(dí)台(tái)盼藍母液(yè)
。在(zài)使用(yòng)時，利用PBS緩衝(chōng)液將(jiāng)母(mǔ)液稀(xī)釋(shì)10倍，使(shǐ)其濃度達(dá)到0.4%，之後再與細胞懸液混(hùn)合(hé)均匀
。

2，BufferA：

包含10mmol/L的HEPES（在(zài)4℃下pH值為7.9），1.5mmol/L的氯(lǜ)化鎂(měi)，10 mmol/L的KCL，0.5mmol/L的二硫(liú)蘇糖(táng)醇（DTT）
。若(ruò)擔(dān)心漿(jiāng)蛋白降(jiàng)解會(huì)對(duì)核蛋白產(chǎn)生影響(xiǎng)，可以(yǐ)添加1mmol/L的(dí)PMSF
。

3，BufferB：

含(hán)有(yǒu)20mmol/L的(dí)HEPES（pH值(zhí)為7.9），體(tǐ)積(jī)分數(shù)為25%的甘油，0.42mol/L的氯化鈉(nà)，1.5mmol/L的氯化(huà)鎂(měi)，0.2mmol/L的(dí)乙(yǐ)二(èr)胺四乙酸(suān)（EDTA），0.5mmol/L的PMSF，0.5mmol/L的二硫蘇(sū)糖(táng)醇（DTT）
。

二(èr)，具(jù)體步(bù)驟

1，使(shǐ)用胰酶將貼壁(bì)細胞消化下(xià)來，把(bǎ)這(zhè)些(xiē)細胞(bāo)收集到(dào)1.5mL EP管(guǎn)中(zhōng)
。4℃以(yǐ)300g的離心(xīn)力離(lí)心5min
。離心完成後(hòu)，用(yòng)PBS緩(huǎn)衝液對細胞(bāo)進行洗滌(2次(cì))
。

2，棄上清(qīng)，加(jiā)入體(tǐ)積為細(xì)胞(bāo)沉(chén)澱5倍(bèi)的預冷(lěng)Buffer A（每20μL的細(xì)胞沉澱加(jiā)入100μL的(dí)Buffer A），之(zhī)後輕輕吹(chuī)打(dǎ)，使(shǐ)細胞(bāo)在(zài)Buffer A中(zhōng)重(zhòng)新懸浮
。

3，將上(shàng)述細胞(bāo)懸浮液在(zài)冰上(shàng)放(fàng)置10min，隨(suí)後(hòu)再次在4℃條件下，以(yǐ)300g的(dí)離(lí)心(xīn)力離(lí)心(xīn)5min
。離(lí)心結束後，加入體積為其(qí)25倍(bèi)的預冷Buffer A，並通過吹(chuī)打操(cāo)作讓細胞重新懸浮
。

4，把經(jīng)過(guò)上(shàng)述處理後(hòu)的細(xì)胞懸液轉移匀漿器(qì)中，準(zhǔn)備(bèi)進行(háng)匀漿操作(zuò)
。

5，在(zài)匀(yún)漿過(guò)程(chéng)中，取出少量(liáng)的(dí)細胞懸(xuán)液(yè)，與等體積的(dí)0.4%台(tái)盼(pàn)藍(lán)染液混合均匀，接(jiē)著(zhuó)在顯(xiǎn)微鏡(jìng)下(xià)觀(guān)察細(xì)胞(bāo)的破膜(mó)情況
。如果觀(guān)察(chá)到(dào)大部分細胞(bāo)都被染(rǎn)成(chéng)了藍(lán)色，就(jiù)停(tíng)止匀(yún)漿操(cāo)作
；要(yào)是(shì)大部分細(xì)胞未(wèi)被染(rǎn)成藍色，則(zé)繼續進(jìn)行(háng)匀(yún)漿
。

6，當大部分細胞(bāo)的(dí)細(xì)胞膜被破壞後(hòu)，將細胞(bāo)懸液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中(zhōng)，然後(hòu)在4℃環境下(xià)，以25000g的離心力離(lí)心(xīn)20min
。

7，離心(xīn)結束後(hòu)，現在上(shàng)清液中包含(hán)的是(shì)細(xì)胞裂解(jiě)物(wù)中的(dí)胞漿成(chéng)分，沉(chén)澱部分則(zé)是(shì)核蛋白
。

8，收集(jí)離(lí)心後的沉(chén)澱，向其中加(jiā)入與(yǔ)沉(chén)澱等體(tǐ)積的預(yù)冷(lěng)Buffer B，然後輕輕(qīng)地(dì)吹打，使(shǐ)沉澱呈現(xiàn)懸浮狀(zhuàng)態(tài)
。接著將懸(xuán)浮液(yè)轉移到(dào)幹(gān)淨的組織(zhī)匀漿(jiāng)器中(zhōng)，以均匀的力(lì)度(dù)進行30次匀漿操(cāo)作
。

9，把經(jīng)過(guò)匀漿(jiāng)的(dí)懸浮(fú)液轉(zhuǎn)移(yí)到Eppendorf管中，放在(zài)冰(bīng)上的(dí)低(dī)速(sù)搖床上振蕩(dàng)45min
。

10，在(zài)4℃條(tiáo)件下，以25000g的(dí)離心力離(lí)心(xīn)30min，收集得到的(dí)上(shàng)清(qīng)液(yè)即為(wéi)細胞(bāo)核(hé)蛋白(bái)

11，提取核蛋白後(hòu)，可使(shǐ)用(yòng)一些(xiē)核蛋白（如(rú)H3蛋白，Lamin蛋白）作(zuò)為對照蛋白，進行(háng)WB驗證(zhèng)
。

注：全部步(bù)驟(zhòu)均需於冰(bīng)上(shàng)操(cāo)作(zuò)
。

，，，代理(lǐ)——天津(jīn)益(yì)元利(lì)康生物(wù)科技(jì)有限公(gōng)司
。