一(yī)，擴(kuò)增(zēng)方式(shì)

擴增(zēng)方式(shì)一般有(yǒu)兩(liǎng)種，對稱擴增(zēng)和不(bù)對(duì)稱擴增。

1，對(duì)稱(chēng)擴增(zēng)

使(shǐ)用(yòng)等量的引(yǐn)物進行PCR擴增(zēng)，擴(kuò)增產物量隨(suí)著(zhuó)PCR循環呈(chéng)指(zhǐ)數(shù)增(zēng)長(cháng)，一(yī)般(bān)的(dí)PCR，使(shǐ)用的(dí)都是(shì)這種方式(shì)。

由(yóu)於TaqDNA聚合酶(méi)具有(yǒu)5’-3’外(wài)切酶活(huó)性，在PCR擴增的過程中會水(shuǐ)解探(tàn)針，導(dǎo)致(zhì)探針被耗(hào)盡，無(wú)法(fǎ)用於熔(róng)曲分(fēn)析(xī)
；若使(shǐ)用抗(kàng)酶切(qiē)修飾的探針(zhēn)，可一定(dìng)程度(dù)降低水解(jiě)，但由(yóu)於(yú)探針(zhēn)阻礙了(liǎo)聚(jù)合酶通過，擴增效(xiào)率會(huì)大幅下(xià)降。

對(duì)稱(chēng)擴增(zēng)產(chǎn)生(shēng)的互補雙(shuāng)鏈，會與(yǔ)探(tàn)針競爭結合靶序列，不利於探(tàn)針(zhēn)結合到靶序(xù)列上，熔(róng)曲分(fēn)析(xī)可能會出(chū)現異(yì)常(cháng)。

優點：靈(líng)敏(mǐn)度(dù)高

缺點(diǎn)：一(yī)般搭(dā)配(pèi)使(shǐ)用媒介(jiè)探針進行檢測，而其他(tā)類型探(tàn)針(zhēn)由於(yú)被切割而(ér)無法(fǎ)使(shǐ)用(yòng)。

2，不對(duì)稱(chēng)擴增

上(shàng)下遊(yóu)引物中，有一條引物(wù)為過量(liáng)使用，一條(tiáo)引物(wù)xian量使(shǐ)用(yòng)，在(zài)PCR擴(kuò)增的(dí)前(qián)期(qī)，擴增(zēng)產物量(liáng)呈指數增(zēng)長，待(dài)xian量引(yǐn)物耗(hào)盡，擴增(zēng)產物(wù)量呈綫(xiàn)性增(zēng)長，產(chǎn)生(shēng)大(dà)量(liáng)的(dí)單鏈(liàn)用於(yú)探針的結(jié)合和熔解(jiě)曲(qū)綫(xiàn)分析(xī)。

LATE-PCR方法中(zhōng)，由於考慮到引物(wù)濃度(dù)對引物Tm值的(dí)影響(xiǎng)，xian量引物(wù)由於(yú)濃度(dù)低(dī)，對模板的(dí)結(jié)合(hé)效(xiào)率(shuài)下降(jiàng)，從而(ér)影(yǐng)響(xiǎng)不(bù)對(duì)稱擴(kuò)增(zēng)前期的擴增(zēng)效(xiào)率(shuài)，因此對(duì)xian量引物的(dí)Tm值進(jìn)行了(liǎo)增(zēng)加(jiā)（即(jí)加多幾個鹼基）。

優(yōu)點：不(bù)會消耗探(tàn)針，探針可用於後續(xù)熔解曲(qū)綫分析

缺點：靈(líng)敏度低(dī)，一般(bān)用於(yú)基因檢測，不(bù)適用(yòng)於病(bìng)原檢(jiǎn)測(cè)（病原(yuán)檢(jiǎn)測(cè)需要高(gāo)靈敏(mǐn)度）

二(èr)，如(rú)何降(jiàng)低非特異性擴增(zēng)？

1，HANDS技(jì)術(shù)（Homo-Tag Assisted Non-Dimer System，同源(yuán)加(jiā)尾無(wú)二聚體係統）

通過對引(yǐn)物添加(jiā)標簽(qiān)，當形成引物(wù)二聚體後(hòu)，由於首尾的(dí)序列互補，會(huì)形(xíng)成發(fā)夾結構，不再作(zuò)為模板進(jìn)行(háng)擴增(zēng)。

2，DPO引(yǐn)物（Dual Priming Oligonucleotide，雙(shuāng)啟動寡(guǎ)核苷酸(suān)）

DPO引物(wù)主要(yào)由(yóu)三個(gè)部分組(zǔ)成，長的(dí) 5'端片段，短的(dí)3'端(duān)片段，中間起(qǐ)連接(jiē)作(zuò)用的(dí)聚(jù)脫氧次黃嘌呤(poly I)。由(yóu)於(yú)脫(tuō)氧次黃(huáng)嘌(piāo)呤(líng)與天(tiān)然鹼基(jī)結合較弱(ruò)，因此(cǐ)相當(dāng)於(yú)與模板(bǎn)DNA形(xíng)成(chéng)了(liǎo)一個氣泡結構。

即使(shǐ)DPO引物(wù)的(dí)較(jiào)長(cháng)的 5'端(duān)部(bù)分(fēn)結合(hé)到(dào)了非(fēi)靶序列部(bù)位，但由於熱(rè)力(lì)學(xué)限(xiàn)製(zhì)，3’端部分(fēn)阻止了(liǎo)非(fēi)特(tè)異結合並有(yǒu)效(xiào)地(dì)阻斷了(liǎo)延(yán)伸。同樣(yàng)由(yóu)於熱力學限製，單(dān)獨(dú)的(dí)3'端(duān)部分在PCR退(tuì)火(huǒ)溫(wēn)度下不能結(jié)合到靶(bǎ)序列上(shàng)。從(cóng)而減(jiǎn)少引物二聚(jù)體(tǐ)的擴增(zēng)。

3，touch-down技(jì)術(shù)

即(jí)降落PCR，在退火(huǒ)階(jiē)段，采用逐級降(jiàng)溫(wēn)的方式，能有效(xiào)減(jiǎn)少非特(tè)異(yì)性擴增。溫(wēn)度(dù)較(jiào)高(gāo)時，由於(yú)非特(tè)異性(xìng)結(jié)合的結合力(lì)較(jiào)弱(ruò)，不利(lì)於非(fēi)特異性擴增，特異(yì)性(xìng)擴(kuò)增(zēng)占優(yōu)勢。

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