一，質(zhì)粒(lì)

質粒(lì)是一種環狀(zhuàng)的(dí)小分(fēn)子 DNA
，是(shì)進行 DNA 重(zhòng)組的常(cháng)用載(zǎi)體(tǐ)
，在分(fēn)子生(shēng)物(wù)學研究(jiū)和基因(yīn)治(zhì)療中對(duì)於質粒的產(chǎn)量(liáng)和質量都(dū)有(yǒu)一定的要求
，其(qí)中超螺旋比(bǐ)例(lì)和(hé)內(nèi)毒(dú)素含量(liáng)是(shì)影響質粒質(zhì)量的兩(liǎng)個(gè)重要因素。

雖(suī)然超(chāo)螺旋(xuán)通常是(shì)主要(yào)形式(shì)
，但在所有質粒製備(bèi)中
，切口(kǒu)和綫性(xìng)DNA形式通(tōng)常作(zuò)為(wéi)次要(yào)形式回收。

但是
，如果操(cāo)作不當的話(huà)
，超螺旋(xuán)形式的DNA質粒(lì)的收獲率可能不(bù)高(gāo)
，那(nà)麼如何提高質粒DNA的超螺旋比(bǐ)例(lì)呢？

二(èr)，提高質(zhì)粒(lì)超(chāo)螺(luó)旋比例(lì)的方法(fǎ)

（1）在(zài)生長平台(tái)期收(shōu)獲(huò)細菌(jūn)培(péi)養(yǎng)物

在對(duì)數(shù)生長(cháng)過程中過早收獲細菌時(shí)
，經常(cháng)會(huì)看(kàn)到(dào)帶切(qiē)口的(dí) DNA。為避免分(fēn)離(lí)出(chū)大(dà)量(liáng)帶切口的DNA
，建議收(shōu)獲(huò)進入生(shēng)長(cháng)平台(tái)期(qī)（生長12-16小(xiǎo)時(shí)後）的細菌。

（2）不(bù)要渦旋和(hé)輕輕(qīng)移液

如(rú)果在(zài)質粒分(fēn)離(lí)過程中(zhōng)將製備(bèi)物渦旋或過(guò)度劇烈(liè)搖晃
，則(zé)可能(néng)會因DNA的機械(xiè)剪切而出(chū)現切口或綫性DNA。所(suǒ)以(yǐ)建(jiàn)議輕輕(qīng)混合
，不(bù)要渦旋(xuán)
，輕輕少量(liáng)地移(yí)液。

（3）切勿過度(dù)使用(yòng)鹼(jiǎn)性(xìng)裂(liè)解液

鹼(jiǎn)性裂解是(shì)從基因(yīn)組(zǔ)DNA中分離(lí)質粒DNA關鍵步驟(zhòu)
，但(dàn)如果(guǒ)過(guò)度(dù)使用(yòng)
，則(zé)可能通(tōng)過將質(zhì)粒長久變性(xìng)為單(dān)鏈(liàn)環狀形式來長久(jiǔ)破壞質粒(lì)的超(chāo)螺(luó)旋。所(suǒ)以建議將(jiāng)裂解的孵(fū)育時間保(bǎo)持在推薦的(dí)時(shí)間
，並在此(cǐ)步(bù)驟(zhòu)中非常輕(qīng)柔(róu)地混(hùn)合(hé)。

（4）小心處(chǔ)理(lǐ)質粒(lì)重懸液(yè)

風幹(gān)後質粒(lì)重懸(xuán)期間(jiān)可能(néng)會(huì)發生剪切(qiē)。質粒越大
，發生(shēng)剪(jiǎn)切(qiē)的可能性就(jiù)越(yuè)大(dà)。沉(chén)澱後輕柔處理(lǐ)製(zhì)備(bèi)物
，讓DNA吸收到水(shuǐ)中
，而(ér)不是(shì)劇烈吹(chuī)打。

（5）避免(miǎn)核(hé)酸(suān)內切(qiē)酶

某些細菌菌株(zhū)含有(yǒu)核(hé)酸內切酶A（endA+）
，可(kě)以綫(xiàn)性化(huà)DNA。建(jiàn)議(yì)將(jiāng)質粒(lì)轉(zhuǎn)化到endA–菌(jūn)株(zhū)中(zhōng)
，則(zé)盡可能高(gāo)效地(dì)進(jìn)行(háng)質(zhì)粒製備(bèi)
，以快(kuài)速將DNA從酶(méi)中移開(kāi)。

（6）保持低(dī)溫

有研究(jiū)表明(míng)在較(jiào)低溫度（4-12°C）下執(zhí)行(háng)所有步(bù)驟(zhòu)會增加(jiā)回(huí)收(shōu)的超(chāo)螺旋質粒的(dí)量(liáng)

三，舉(jǔ)例

如圖所示
，質粒(lì)提取之(zhī)後進行(háng)瓊脂糖(táng)凝膠電(diàn)泳(yǒng)
，開環質粒的占(zhān)比(bǐ)約20%
，說明(míng)超(chāo)螺旋比例低
，一般超螺旋(xuán)比例需(xū)要＞90%
，一般來(lái)說超(chāo)螺旋(xuán)比(bǐ)例越高
，質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高
，高超螺(luó)旋(xuán)比例的質(zhì)粒在轉染效(xiào)率，基(jī)因表(biǎo)達水平(píng)等方麵(miàn)具有更(gēng)好的表(biǎo)現。

原因(yīn)：裂解(jiě)時間(jiān)不(bù)宜過長
，加入裂(liè)解液後裂(liè)解時間不應(yīng)超(chāo)過5分鐘(zhōng)
，以免質(zhì)粒(lì)受到破壞(huài)

解決方(fāng)法：優(yōu)化裂(liè)解(jiě)時(shí)間
；確保質(zhì)粒(lì)的(dí)結合和所有(yǒu)溶(róng)液(yè)都(dū)在室(shì)溫(wēn)下進(jìn)行
，減(jiǎn)少離心(xīn)力(lì)對(duì)質(zhì)粒超螺(luó)旋結(jié)構的影響
，因為過度(dù)的離心(xīn)可能(néng)會破(pò)壞(huài)質粒的超螺旋(xuán)結構(gòu)。

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，或(huò)境(jìng)外代(dài)理）
；

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，二代(dài)+三(sān)代(dài)）
；

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；

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；

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